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CRISTIAN
Nuovo Arrivato
92 Messaggi |
 Inserito il - 26 febbraio 2007 : 10:24:19
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Ciao a tutti avrei bisogno di un aiuto..qualcuno di voi ha un protocollo per estrarre la proteina da una coltura batterica overnight del plasmide pet21a indotto con IPTG.
Attualmente io mi limito a centrifugare per ottenere il pellet, dei lavaggi con PBS1X, risospensione con PBS 1X, sonicazione, centrifugazione ad alta velocità e poi tengo il surnatante contenente la proteina.Successivamente procedo con una cromatografia.
Però ho notato che la proteina si degrada facilmente, forse dovrei usare degli inibitori di proteasi per la risospensione?
Se qualcuno sa aiutarmi vi ringrazio.......GRAZIE
Cristian
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Fil23
Utente Junior
Prov.: estero
Città: London
238 Messaggi |
Inserito il - 26 febbraio 2007 : 10:38:19
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Ciao,
io solitamente il pellet lo risospendo con un tampone di lisi...io uso il TRIS, ma il PBS è uguale...aggiungici una pasticca di inibitore della proteasi (si comperano e sono in pasticche...1pasticca x ogni 50ml di tampone), poi aggiungo DNAsi (una punta di spatola x 50ml di ampone) e lisozima (1 punta di spatola x 50 ml di tampone).
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 26 febbraio 2007 : 14:12:26
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Ciao!
Io usavo questo protocollo, (più o meno come Fil):
- centrifugare le colture in falcon da 50-ml a 5000rpm per 15min. a 4°C
- mettere le provette invertite su carta bibula pulita per farle asciugare
- risospendere il pellet in buffer di omogeneizzazione (10 mM Tris-Cl pH 7.5) con Protease inhibitors (1 pastiglia in 50ml)
Poi procedevo con digestione enzimatica con Lysozima (non avendo il sonicatore!):
- aggiungere 1/10 vol. di Lysozima (10mg/ml ) e incubare a 37°C per 30 min. in bagnetto in agitazione
- Congelare rapidanente in azoto liquido e scongelare incubando a 37°C per 15 min.
- Aggiungere 1/10 volume di DNasi (1mg/ml) e 10x DNasi Buffer agitare per 15-30min.
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CRISTIAN
Nuovo Arrivato
92 Messaggi |
Inserito il - 26 febbraio 2007 : 14:33:07
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Quindi io dopo aver risospeso in un buffer con inibitori di proteasi, sonico e anzichè aggiungere il lisozima aggiungo direttamente DNasi e Buffer DNasi per mezz'ora?
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Fil23
Utente Junior
Prov.: estero
Città: London
238 Messaggi |
Inserito il - 26 febbraio 2007 : 14:57:30
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Io sinceramente faccio tutto insieme, cioè aggiungo lisozima, inibitore, DNAsi al buffer con cui risospendo le cellule. Le cellule in questo buffer poi le sonico. Se al buffer metti il lisozima è meglio perchè hai una lisi più completa e soprattutto sonichi più blandamente e per meno tempo...la sonicazione è un passaggio critico nell'estrazione proteica...se scalda tanto le proteine possono denaturarsi.
Poi ultracentrifughi il tutto, prendi il sopranatante e prosegui con la normale purificazione. |
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CRISTIAN
Nuovo Arrivato
92 Messaggi |
Inserito il - 26 febbraio 2007 : 15:31:06
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grazie infinite
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PRODURRE PROTEINA
Didattica
