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Inserito il - 16 giugno 2016 : 16:48:30

Salve a tutti,
avrei una domanda riguardante il sistema crispr.
Ho ordinato il plasmide LentiV2 crispr da addgene e vorrei provare a clonare il gRNA all�interno attraverso il Fusion HD cloning kit.
Il problema � che questo kit necessita delle blunt ends per far avvenire la ricombinazione mentre il mio vector digerito presenta le sticky-ends.
Per questo motivo ho pensato di utilizzare il frammento di Klenow per generare le blunt ends nel vettore e tentare il cloning con questo kit. Pensate sia possibile? Sul 5� le basi mancanti vengono aggiunte ma sul 3�vengono degradate 4 basi. Guardando la mappa del plasmide queste 4 basi non sono altro che le sticky ends che servivano per riconoscere il gRNA. Pensate che possa essere un problema non avere queste 4 basi per il funzionamento del vector?
Ad ogni modo stavo controllando il protocollo per questo kit e dice:

Set up the In-Fusion cloning reaction:
2 ul 5X In-Fusion HD Enzyme Premix
x ul* Linearized Vector
x ul* Purified PCR Fragment
x ul dH2O (as needed)
10 ul Total Volume

La mia domanda � visto che il Fragment non lo genero con PCR, ma compro direttamente l�oligo contenente il gRNA e le 15 bp omologhe, quanto mi consigliate di aggiungere nella mix reaction del fragment?
Il vettore posso risalire alla concentrazione e quindi anche per l�acqua� ma per il fragment non ho idea. Di solito nei protocolli normali di cloning aggiungo 1 ul di oligo duplex, potrebbe andare bene anche in questo caso?

Grazie mille a chiunque mi aiuti