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Autore

Discussione

le990
Nuovo Arrivato

3 Messaggi

Inserito il - 07 ottobre 2017 : 10:59:53

Buongiorno a tutti,
ho alcuni problemi con la melting curve di un gene...vi allego immagine per essere pi� chiara...mi si forma un prodotto aspecifico..secondo voi � legato a dimessi di primers? ho provato ad alzare la temperatura fino a 63�C... avete suggerimenti in merito? come posso procedere? secondo voi devo ridisegnare i primers?
grazie per chi potr� aiutarmi

Immagine:

1197233

Caffey
Utente Attivo

Citt�: Perugia

1496 Messaggi

Inserito il - 08 ottobre 2017 : 11:38:17

Ciao.
Spero che qualche moderatore incroci questa discussione e riduca le dimensioni dell'immagine che hai caricato.
In ogni caso a me il primo picco sembra proprio dei dimer di primer.
Se non ti dispiace, potresti dirci la sequenza dei tuoi primer cosicch� possa verificare una cosa?

Geeko
Utente

Citt�: Milano

1043 Messaggi

Inserito il - 08 ottobre 2017 : 11:52:24

Anche a me sembra un dimero, hai provato a caricare su gel il prodotto di PCR? Puoi provare a testare altre temperature di annealing, pi� alte di 63�C. Se il tuo termociclatore te lo consente puoi provare con un gradiente usando anche varie diluizioni (di 10 in 10) di un campione di prova per testare anche l'efficienza e con una singola corsa magari trovi gi� la temperatura ottimale.

GFPina
Moderatore

Citt�: Milano

8408 Messaggi

Inserito il - 10 ottobre 2017 : 18:12:17

Citazione:
Messaggio inserito da Caffey

Spero che qualche moderatore incroci questa discussione e riduca le dimensioni dell'immagine che hai caricato.

Fatto!

Comunque, s� anche a me sembrano dimeri di primers!
Mi associo alle risposte precenti.
Dovresti anche analizzare i tuoi primers con un programma di analisi di primers per vedere se formano dimeri.
Inoltre puoi fare delle PCR end-point a diverse temperature per cercare di risolvere il problema e trovare le condizioni ottimali prima di rifare la real-time.

le990
Nuovo Arrivato

3 Messaggi

Inserito il - 12 ottobre 2017 : 16:48:42

Grazie per le vostre risposte,
ho inserito i primers nel programma "Amplify" e non sembrano formare dimeri...prover� comunque ad alzare la temperatura come mi avete suggerito...se avete altri suggerimenti sono ben accetti :)