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weinbuc
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1 Messaggi

Inserito il - 08 novembre 2019 : 19:43:08  Mostra Profilo Invia a weinbuc un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
La tecnica è stata usata per comprendere se due proteine interagiscono fisicamente tra loro(in particolare la pRb e la proteina e2f). Vi spiego quello che ho capito.
Al lisato cellulare viene aggiunta una certa quantità di anticorpo per pRb, poi viene aggiunta un'altra quantità di un secondo anticorpo che riconosce il primo, a questo secondo anticorpo è legata una biglia di agarosio, centrifugando blandamente il complesso anticorpo con biglia-anticorpo-pRb-e2f dovrebbe precipitare, si elimina il surnatante e nel precipitato dovrebbe esserci il complesso. in questo modo mi pare di aver capito che si è semplicemente separato il complesso (pRb-e2f da tutto il resto contenuto nel lisato)
Da qui in poi non ho capito più quello che ci ha cercato di spiegare la Prof.
Il precipitato lo fanno correre su gel da quello che ho capito fanno una sds page e in questo caso però i complessi proteici dovrebbero dissociarsi dato che l'sds dovrebbe rompere tutti i legami deboli, poi fanno western-blot in una con anticorpo per pRb e l'altra con anticorpo per e2f. in entrambi i casi dovrebbero visualizzare la positività ma questo per me dimostra solo che co precipitano, non dimostra che interagiscono.(forse indirettamente questo dimostra anche che interagiscono?)
potete spiegarmi questo insieme di tecniche per dimostrare l'interazione fisica tra proteine? Grazie.

domi84
Moderatore

Smile3D

Città: Glasgow


1704 Messaggi

Inserito il - 09 novembre 2019 : 17:02:44  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di domi84 Invia a domi84 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Sembra tutto corretto.

Citazione:

ma questo per me dimostra solo che co precipitano, non dimostra che interagiscono.


Fammi un esempio di due proteine che co-precipitano ma NON interagiscono allora...

Citazione:

con anticorpo per pRb e l'altra con anticorpo per e2f. in entrambi i casi dovrebbero visualizzare la positività


L'anticorpo per pRb dovrebbe darti sempre una banda (è un controllo). L'anticorpo per e2f ti dà una banda solo le interagiscono, altrimenti no. Quello è il risultato del tuo esperimento.

Il mio blog: http://domi84.blogspot.com/
Le foto che ho scattato...
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