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Luca-DNA
Nuovo Arrivato
Prov.: Torino
Città: Torino
68 Messaggi |
 Inserito il - 04 marzo 2008 : 20:30:29
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Puoi usare tamponi di lisi come EB, RIPA, NP40...
Praticamente se hai le cellule in piastre, aspiri il terreno, lavi bene con PBS (io in genere faccio 2 lavaggi con PBS per togliere bene le proteine del siero che poi ti andranno ad invalidare la quantificazione degli estratti), e poi sulla piastra asciutta aggiungi il tampone di lisi.
Lasci agire un po' il tampone e poi usi uno screaper per staccare le cellule...
Poi raccogli tutto in eppendord e lasci in agitazione per almeno 15 minuti (meglio mezz'ora...) in modo tale da lisare bene le cellule. Alla fine chiarifichi il lisato, centrifugando a max velocità per almeno 15 minuti (meglio mezz'ora), prelevi il surnatante e lo trasferisci in una nuova eppendorf (il surnatante contiene le proteine estratte mentre il pellet i residui delle membrane e detriti cellulari).
In alternativa all'uso dello screaper si può anche staccare le cellule con tripsina, raccogliere tutto in un falcon, centrifugare e risospendere il pellet con PBS, centrifugare nuovamente e risospendere il pellet con PBS, centrifugare e risospendere il pellet con tampone di lisi...lasciare in agitazione e poi chiarificare il lisato e raccogliere il surnatante in una nuova eppendorf.
In questi metodi è importante stare in ghiaccio in tutti i passaggi e centrifugare con centrifughe refrigerate per non degradare il lisato e per non attivare le fosfatasi (anche se si possono aggiungere inibitori per le fosfatasi, così come per le proteasi).
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A scientific man ought to have no wishes, no affections, - a mere heart of stone. (C. Darwin) |
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