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hurricane86
Nuovo Arrivato
50 Messaggi |
 Inserito il - 13 maggio 2008 : 21:31:36
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sera ragazzi!!
ho un problema in laboratorio,abbiamo un plasmide (pYM6) con un inserto di un gene da amplificare in PCR.
i primer hanno un segmento al 3' coincidente (teoricamente) con le estremità del gene che vogliamo appaiare ed hanno un'ala al 5' che non si appaia (serve per far poi ricombinazione omologa).
Quando controlliamo la PCR in elettroforesi compaiono solo gli oligo, e malamente tra l'altro.
il plasmide è stato controllato con gli enzimi di restrizione ed è a posto, la taq e gli oligo son nuovi, la temperatura di anniling è stata variata più volte ma non cambia nulla; anzi per assurdo sembra dare miglior risultato una temperatura più alta..(non che si veda molto, solo una banda fantasma.....perdonatemi ma non sarebbe più logico il contrario?! una temparatura più bassa favorirebbe un appaiamento anche con primer a meno stringenza e quindi portare ad un numero maggiore di risultati?!?!
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Think I'll lose my mind if I don't find something to pacify
....muore lentamente chi non esplora cio che non conosce.... |
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darkene
Utente Junior
291 Messaggi |
Inserito il - 13 maggio 2008 : 21:52:05
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1. prova a cambiare Taq
2. usa DMSO
3. fai più cicli
4. prova a cambiare oligo |
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hurricane86
Nuovo Arrivato
50 Messaggi |
Inserito il - 13 maggio 2008 : 22:04:11
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che cosa potrebbe cambiare col DMSO?!?!
(son poco pratica in laboratorio ho iniziato da poco)
grazie mille in anticipo |
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1912 Messaggi |
Inserito il - 14 maggio 2008 : 09:49:01
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| dovrebbe far si che le strands rimangano aperte o facilitare l apertura... a me non e' cambiato niente,e sono convinto che miracoli non ne fa |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 14 maggio 2008 : 11:00:56
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| Ah, valuta pure il tempo di allungamento: prova a cambiarlo. |
Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
Less Jim Morrison, more Sean Morrison!
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hurricane86
Nuovo Arrivato
50 Messaggi |
Inserito il - 14 maggio 2008 : 19:30:29
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bha non funziona neancora
i cicli son 35 ormai se metto di più mi esce un cordino di canapa xD
la taq abbiamo fatto la prova con la fusion
il DMSO che ci sia o no non cambia nulla
e abbiamo rifatto gli oligo
o siamo tutti imbecilli o c'è un grosso problema!!! |
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valia
Moderatore
Prov.: UK
1001 Messaggi |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 14 maggio 2008 : 20:37:34
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Citazione:
Messaggio inserito da hurricane86
.... un'ala al 5' che non si appaia (serve per far poi ricombinazione omologa).
mmm ma questa "ala" al 5' com'è???
è una regione estesa? si appaia, cioè fa formare dimeri di primers?
(mi sembra un déjà vu!!!)
... non saranno mica i siti attB ???
Il fatto poi che tu veda gli oligo in elettroforesi e che la PCR dia un seppur minimo risultato ad una T più elevata, mi fa pensare che la situazione sia questa: i primers formano dimeri che sono molto stabili e non si appaiano alla sequenza, aumentando la temperatura sfavorisci la formazione dei dimeri.
Non avete provato a fare una PCR con oligo senza la codina al 5'?
Potresti anche provare con un eccesso di primers e variare altri parametri, cercando di aumentare la resa a sfavore della specificità (tanto poi puoi sempre isolare la banda da gel)
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