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Autore

Discussione

byo_gio
Nuovo Arrivato

Prov.: MI
Citt�: Milano

66 Messaggi

Inserito il - 28 settembre 2009 : 19:21:19

Vi propongo una questione tecnica.

Normalmente, in un western blot semiquantitativo si usa re-incubare una membrana con una proteina intrinseca tipo GAPDH o actina o tubulina per controllare la quantita' di campione caricata nelle corsie del gel.

Nel caso di campioni immunoprecipitati pero', tali proteine intrinseche non sono presenti poiche si tratta di un concentrato di poche proteine.

Alcuni usano allora normalizzare usando la proteina "esca"... i cui livelli basali potrebbero pero' variare tra un campione e l'altro in seguito a trattamenti.

Altri invece controllano solo che ci sia una uguale quantita' di immunoglobuline in ogni corsia, visibile con la banda da 50 kDa delle catene pesanti.

Che ne pensate???

grazie, ciao!

nomis
Nuovo Arrivato

Citt�: roma

16 Messaggi

Inserito il - 06 ottobre 2009 : 12:58:52

� sempre un problema la normalizzazione nelle ip inquanto tutto � indicativo. ricorda comunque che non � un'analisi quantitativa. io prima della ip prelevo sempre una quantit� di lisato da correre per wb. in modo da verificare l'espressione delle proteine di interesse e normalizzarle con un loading control. dallo stesso lisato (lettura fatta lo stesso giorno!!!cos� le condizioni sono identiche) immunoprecipito e mi affido ai livelli di immunoglobuline. un'altra cosa che puoi fare (che � un po la prove del nove) � correre circa 1/20 del sovranatante dell'IP e controllare i livelli di espressione delle proteine che non si sono legate
spero di esser stat chiara!!!

Gst
Utente Junior

Prov.: Roma
Citt�: Ariccia

143 Messaggi

Inserito il - 25 ottobre 2009 : 11:50:42

Nomis

carina l'idea di correre 1/20 del sovranatante dell'IP. quello lo usi per vedere l'actina o altro normalizzatore? per vedere se hai incubato la stessa quantit� di prot nei diversi campioni dell'IP?

Ho capito bene?

Io in genere vedo la quantit� della proteina immunoprecip negli estratti su cui ho fatto l'IP (prelevati da ogni campione prima di mettere su l'IP e denaturati: sono gli estratti totali dell'IP) e poi controllo la quantit� della proteina immunoprecip anche nell'immunoprecip. Se la quantit� di prot era uguale negli estratti totali allora se le IP sono bilanciate dovr� esserlo anche nelle IP.

Ascoltami con gli occhi...

byo_gio
Nuovo Arrivato

Prov.: MI
Citt�: Milano

66 Messaggi

Inserito il - 12 febbraio 2010 : 19:33:29

Citazione:
Messaggio inserito da Gst

Nomis carina l'idea di correre 1/20 del sovranatante dell'IP. quello lo usi per vedere l'actina o altro normalizzatore? per vedere se hai incubato la stessa quantit� di prot nei diversi campioni dell'IP?

Ho capito bene?

Io in genere vedo la quantit� della proteina immunoprecip negli estratti su cui ho fatto l'IP (prelevati da ogni campione prima di mettere su l'IP e denaturati: sono gli estratti totali dell'IP) e poi controllo la quantit� della proteina immunoprecip anche nell'immunoprecip. Se la quantit� di prot era uguale negli estratti totali allora se le IP sono bilanciate dovr� esserlo anche nelle IP.

Scusa, potresti spiegarti un po' meglio?
cosa intendi per estratto, estratto totale, proteina immunoprecip ???
grazie ciao