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Donde
Utente Junior
272 Messaggi |
 Inserito il - 09 giugno 2011 : 21:33:33
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ciao a tutti! ho bisogno di aiuto per chiarire alcuni dubbi riguardo l'estrazione di DNA plasmidico con kit.
per l'estrazione di plasmidi da batteri e. coli usiamo un kit della invitrogen. il kit esiste in formato mini, midi e maxi.
noi possediamo quello midi. tuttavia, mi è stato detto che non abbiamo falcon da 50 ml adatte per la centrifugazione a 15.000 G (che andrebbe fatta dopo aver lisato i batteri), quindi dobbiamo usare le eppendorf. di conseguenza i volumi che usiamo sono stati adattati per essere compatibili con la eppendorf da 1,5 ml.
in particolare, all'inizio il pellet con i batteri viene risospeso in una soluzione di risospensione pari a 0,4 ml a cui viene aggiunta una soluzione di lisi in volume pari a 0,4 ml e altri 0,4 ml di una soluzione di precipitazione. secondo il protocollo, invece, i volumi dovrebbero essere 4 ml + 4 ml + 4 ml, cioè 10 volte di più.
quindi dopo la centrifugazione, il supernatante ottenuto, che viene aggiunto alla colonna, è 10 volte meno di quello che si otterrebbe se venissero rispettati i volumi indicati nel protocollo. per il lavaggio e l'eluizione si usano invece i volumi indicati nel protocollo, che vengono divisi in 5 o 6 eppendorf. le eppendorf sono poi centrifugate, ed il pellet ottenuto da tutte le eppendorf è unito insieme passando da una provetta all'altra con la soluzione di risospensione.
quello che mi chiedo io è questo: tutto ciò può influire sulla qualità/quantità di DNA estratto. se sì, quanto? la quantità di DNA che riusciamo ad estrarre dopo ogni estrazione sembra molto variabile. a volte è 0,002 ug/ul, altre volte è 2,6 ug/ul.
grazie mille per l'aiuto ;)
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"DNA just is. And we dance to its music." |
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 09 giugno 2011 : 22:01:55
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A me pare una scelta ridicola quella di ri-adattare volumi da falcon a volumi da eppendorf. non potete procurarvi delle falcon da 50 ml buone?una resa di 2.6 ug/ul è buona,anche se si puo' fare di meglio, ma 0.002/ul (2 ng!!!) da una midi è inaccettabile.
Se non potete usare altre falcon, ti consiglierei di ridurre la velocità di centrifugazione. Cosi' nn ti si spaccano le falcon. |
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Martin.diagnostica
Utente Attivo
1582 Messaggi |
Inserito il - 09 giugno 2011 : 22:25:57
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Ma non sai il riferimento del kit? la colonna di che tipo è? di quelle che si inseriscono nelle eppendorf?
Penso che la modifica del protocollo potrebbe causare qualche problema a livello di lisi inclompleta dei batteri e quindi bassa resa.
Volendo quindi rispettare i volumi della lisi
1. coltura di 100mL ?
2. Centrifuga in 2 falcon da 50 mL (normali) a basso numero di rpm
3. Risopendere bene il pellet in 4mL 2mL per falcon
4.|Separare la sospensione in 8 eppendorf da 2mL (0.5mL per epp)
5. Ad ogni epp aggiungi 0.5mL +0.5mL + 0.5mL ad ogni eppendorf (in tot =2ml)
6 centrifughi a 15 KG e continui come hai descritto.
Per curiosità una miniprep dovrebbe fornire mediamente 15ug/50uL quindi 0.3 ug/uL la tua rese dovrebbe essere credo almeno 10 volte in più.
Citazione:
Se non potete usare altre falcon, ti consiglierei di ridurre la velocità di centrifugazione. Cosi' nn ti si spaccano le falcon.
si se non erro era un accorgimento che ho usato una volta mi sembra che i falcon rimangono interi fino ad 8000 G
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 10 giugno 2011 : 10:02:18
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io uso i falcon a 10000rpm per un tempo di 10 minuti superiore a quello indicato dal libretto istruzioni. i falcon non si sono mai rotti.
ps: a questo punto non vi converrebbe direttamente comprare i kit da miniprep? con questi volumi mi viene meno proprio il concetto di midi... |
...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
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Donde
Utente Junior
272 Messaggi |
Inserito il - 11 giugno 2011 : 16:11:49
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grazie a tutti per l'aiuto, non immaginate quanto mi sia prezioso. purtroppo non ho la possibilità di ottenere falcon migliori, né kit diversi, quindi devo adattarmi ad usare quello che ho..
potrei provare a centrifugare a 8000 G, sperando che funzioni. il tempo di centrifugazione secondo protocollo dovrebbe essere 45 min a 15.000 G. se io centrifugo a 8000 G secondo voi mi conviene aumentare il tempo?
inoltre il kit indica di usare volumi diversi di coltura batterica a seconda che il plasmide sia a basso oppure ad alto numero di copie. c'è un modo per sapere che tipo di plasmide abbiamo? devo chiedere direttamente al laboratorio dove è stato sintetizzato?
Citazione:
Messaggio inserito da Martin.diagnostica
Ma non sai il riferimento del kit? la colonna di che tipo è? di quelle che si inseriscono nelle eppendorf?
il kit dovrebbe essere questo http://products.invitrogen.com/ivgn/product/K210004#manuals
Citazione:
Messaggio inserito da Martin.diagnostica
Volendo quindi rispettare i volumi della lisi
1. coltura di 100mL ?
2. Centrifuga in 2 falcon da 50 mL (normali) a basso numero di rpm
3. Risopendere bene il pellet in 4mL 2mL per falcon
4.|Separare la sospensione in 8 eppendorf da 2mL (0.5mL per epp)
5. Ad ogni epp aggiungi 0.5mL +0.5mL + 0.5mL ad ogni eppendorf (in tot =2ml)
6 centrifughi a 15 KG e continui come hai descritto.
ti ringrazio ;) il problema è che non so neanche se abbiamo le eppendorf da 2 ml. credo che abbiamo solo quelle da 1,5 ml.. userò magari un numero maggiore di provette. |
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 11 giugno 2011 : 16:58:11
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Citazione:
Messaggio inserito da Donde
purtroppo non ho la possibilità di ottenere falcon migliori
io mi riferivo a comunissimi tubi corning, quelli col tappo arancione, per intenderci.
Citazione:
Messaggio inserito da Donde
il tempo di centrifugazione secondo protocollo dovrebbe essere 45 min a 15.000 G. se io centrifugo a 8000 G secondo voi mi conviene aumentare il tempo?
ovvio, aumentalo di 15' e vedi se ottieni un buon pellet
Citazione:
Messaggio inserito da Donde
inoltre il kit indica di usare volumi diversi di coltura batterica a seconda che il plasmide sia a basso oppure ad alto numero di copie. c'è un modo per sapere che tipo di plasmide abbiamo? devo chiedere direttamente al laboratorio dove è stato sintetizzato?
per questo ti basta sapere che tipo di vettore stai usando...
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Donde
Utente Junior
272 Messaggi |
Inserito il - 14 giugno 2011 : 16:48:55
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ho provato ad usare 30 ml di coltura batterica e seguire i volumi indicati dal protocollo. ho centrifugato a 8.000 G invece che a 15.000 G e ho ottenuto lo stesso un buon pellet.
il problema però è che applicando il DNA sul gel di agarosio, pur essendo in quantità molto più elevate del solito, appare degradato. In quale passaggio dell'estrazione potrei aver causato la degradazione del DNA? |
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Martin.diagnostica
Utente Attivo
1582 Messaggi |
Inserito il - 14 giugno 2011 : 17:17:59
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Citazione:
Messaggio inserito da Donde
ho provato ad usare 30 ml di coltura batterica e seguire i volumi indicati dal protocollo. ho centrifugato a 8.000 G invece che a 15.000 G e ho ottenuto lo stesso un buon pellet.
il problema però è che applicando il DNA sul gel di agarosio, pur essendo in quantità molto più elevate del solito, appare degradato. In quale passaggio dell'estrazione potrei aver causato la degradazione del DNA?
Postaci la fotose puoi? |
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Donde
Utente Junior
272 Messaggi |
Inserito il - 14 giugno 2011 : 18:25:34
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Citazione:
Messaggio inserito da Martin.diagnostica
Postaci la fotose puoi?
ecco la foto del gel http://imageshack.us/photo/my-images/707/20110613plasmidg172ste.png/
a sinistra c'è un campione di controllo che ho estratto in passato usando le eppendorf. a destra c'è il DNA estratto ieri.
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Martin.diagnostica
Utente Attivo
1582 Messaggi |
Inserito il - 14 giugno 2011 : 19:18:31
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a me nn sembra degradato, diciamo che c'è ne un botto fai un gel caricando diluizioni progressive del tuo campione vedi se la situazione migliora
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SpemannOrganizer
Utente
Città: Los Angeles
955 Messaggi |
Inserito il - 14 giugno 2011 : 20:05:18
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ma nn usi nessun ladder? Usalo perchè ti è di enorme aiuto nell'interpretazione di cio' che vedi nel gel (oltre che nelle digestioni). In effetti cosi' mi sembra degradato, in maniera non dissimile da quello ottenuto con la miniprep. Dubito infatti che le diverse bande che hai appartengano alle varie forme del plasmide (nick-relaxed, linear, supercoiled).
Direi di correre ancora il plasmide, in quantità minore (caricane 100 nanogrammi) insieme a un ladder e a un altro plasmide "buono" (non quello che hai messo tu a sx che onestamente -senza offesa ci mancherebbe- fa un pochino schifo).
Facci sapere |
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 14 giugno 2011 : 23:28:06
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| a me nemmeno pare degradato, ma concordo che ne hai corso troppo. hai fatto il dosaggio prima di caricare sul gel? il gel è all'1%? |
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Martin.diagnostica
Utente Attivo
1582 Messaggi |
Inserito il - 14 giugno 2011 : 23:33:47
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Citazione:
Messaggio inserito da SpemannOrganizer
ma nn usi nessun ladder? Usalo perchè ti è di enorme aiuto nell'interpretazione di cio' che vedi nel gel (oltre che nelle digestioni). In effetti cosi' mi sembra degradato, in maniera non dissimile da quello ottenuto con la miniprep. Dubito infatti che le diverse bande che hai appartengano alle varie forme del plasmide (nick-relaxed, linear, supercoiled).
Direi di correre ancora il plasmide, in quantità minore (caricane 100 nanogrammi) insieme a un ladder e a un altro plasmide "buono" (non quello che hai messo tu a sx che onestamente -senza offesa ci mancherebbe- fa un pochino schifo).
Facci sapere
Ma hai digerito il plasmide con 1 enzima di restrizione prima di caricarlo ? |
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Donde
Utente Junior
272 Messaggi |
Inserito il - 15 giugno 2011 : 14:00:50
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| il gel è all'1,2 % e il plasmide NON è digerito.. |
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Martin.diagnostica
Utente Attivo
1582 Messaggi |
Inserito il - 15 giugno 2011 : 18:44:03
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| allora sono i superavvolgimenti quelle bande multiple, aggiungi una line di plasmide digerito cosi controlli anche la dimensione (se nn costa troppo) |
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estrazione DNA plasmidico con kit.. chiedo aiuto
Didattica e Relazioni
