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Autore

Discussione

nettola
Nuovo Arrivato

Citt�: lecce

26 Messaggi

Inserito il - 16 agosto 2011 : 14:26:42

ciao a tutti! nei miei appunti c'� scritto che il DNA introdotto per trasformazione pu� essere mantenuto nel nuovo organismo integrandosi in un plasmide preesistente. Per fare ci� per� si usa come metodo di trasformazione il "plasmid rescue". perch�? e in che cosa consiste il "plasmid rescue"?

nettola

SpemannOrganizer
Utente

Citt�: Los Angeles

955 Messaggi

Inserito il - 16 agosto 2011 : 14:59:54

mah, io per plasmid rescue conosco questa tecnica:
si fa integrare un plasmide linearizzato (magari contenente alle sue estremit� siti di riconoscimento per trasposasi) in un DNA genomico ospite. Questo vettore contiene anche un sito unico di restrizione,ad esempio EcoRI, quindi presente una sola volta nel plasmide. Una volta avvenuta l'integrazione, si digerisce il DNA genomico estratto con EcoRI. Successivamente si utilizza la ligasi, per "incollare" i vari frammenti di DNA ottenuti: cosi' facendo, promuoverai la formazioni di tanti circoletti, cio� di tante molecole circolari di DNA.
Infine si trasforma E. coli con questo DNA circolare ottenuto in vitro: solo il DNA contenente il plasmide originario (provvisto di resistance gene e di origine di replicazione) piu' l'eventuale sequenza genomica che si porta appresso, sar� in grado di promuovere la formazione di colonie batteriche.

P.S.: anche se EcoRI � contenuto una sola volta nel plasmide, il sito � probabilmente presente innumerevoli volte nel DNA genomico. La digestione con questo enzima promuover� quindi l'escissione del plasmide con una sequenza + o - lunga di genomico fiancheggiante il plasmide nel sito in cui si era integrato. Questo puo' essere utile per clonare e identificare (tramite sequenziamento) sequenze regolatrici come enhancer o promotori o ancora geni.

Allego una immagine carina e molto informativa
http://www.nature.com/nrg/journal/v2/n10/fig_tab/nrg1001-756a_F4.html#figure-title