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apora88
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 Inserito il - 30 giugno 2012 : 17:37:36
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Ciao a tutti. Volevo proporvi un piccolo esercizio di biologia molecolare il testo recita così: una malattia genetica autosomica recessiva è causata dalla delezione del tratto tra il nucleotide -10 e il nucleotide -530 del gene di cui conosce la sequenza.
a) dal punto di vista dell'espressione genica, quale risultato si aspetta da una RT-PCR quantitativa eseguita sull'RNA di una persona portatrice di tale delezione rispetto ad una persona sana?
b) motivi la risposta data alla domanda a).
In teoria la risposta sarebbe che dato che si tratti di una delezione la RT-pcr della persona sana mostra l'amplificato rispetto alla persona malata in cui nn ci sarà giusto?
Inoltre volevo proporvi un altro quesito
Una malattia genetica autosomica è dovuta all'inserzione di un frammento di 200bp nel secondo esone di un gene di cui conosce la sequenza
a) disegni una strategia basata sulle tecniche di bio mol che diventi un test diagnostico sicuto e d facile applicazione
b) Mostri il possibile risultato dell'applicazione di tale test nell'ipotesi che una coppia in attesa di un figlio richieda l'analisi prenatale
Quello che voglio chiedervi è
nella domanda a) posso fare una semplice pcr o per forza una RT-pcr quantitativa?
inoltre per rispondere alla domanda b) nell'ipotesi che il figlio non sia malato, non avremo l'amplificato della sequenza visto che l'inserzione non c'è? E se ci fosse? si amplificherebbe normalmente?
Grazie a tutti ma sono molto confusa
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 30 giugno 2012 : 18:05:18
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Sono un po'impegnato, dunque scusa la brevità.
Circa il secondo quesito,
punto a)
cosa ti interessa davvero? Sapere se c'è o non c'è una certa sequenza di DNA o in che quantità è prodotto il suo trascritto?
Una PCR dà una risposta binaria: SI/NO, cioè tale sequenza è/non è presente.
Una PCR quantitativa dà informazioni su una quantità invece.
Punto b)
come intendi disegnare i primer? Ossia, dove vorresti che si appaiassero? Se disegnassi primer che si appaiassero all'interno dell'inserzione, avresti un amplificato in PCR nel caso tale sequenza sia presente, mentre nessun'amplificazione qualora l'inserzione sia assente. Concordi?
Ma se i genitori fossero eterozigoti? Il rilevare un'amplificazione non ti permetterebbe di discriminare tra eterozigote ed omozigote sano, concordi? EDIT: Ovviamente ciò vale anche se l'analisi fosse condotta sul feto FINE EDIT.
Cosa succederebbe se invece ponessi i primer di modo tale che fiancheggiassero, ma fossero esterni, all'inserzione? Potresti distinguere tra omo- ed eterozigosi? La risposta è si, prova a motivarla. |
So, forget Jesus. The stars died so that you could be here today.
A Universe From Nothing, Lawrence Krauss
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apora88
Nuovo Arrivato
7 Messaggi |
Inserito il - 30 giugno 2012 : 18:40:09
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Per rispondere al questito a mi è stata d'aiuto la sua spiegazione del punto b. A questo punto con una normale pcr,in caso di eterozigosi vedrei comunque l'amplificato, ma questo non mi sarebbe d'aiuto per un'eventuale diagnosi quindi effettuerei una RT-PCR.
Tuttavia non sono ancora in grado di rispondere, anzi di motivare la sua risposta al quesito b.
Approfittando della sua gentilezza, volevo chiederle nella domanda a) del primo quesito, quella che mi chiedeva riguardo alla differenza dell'espressione genica di un individuo sano rispetto a quello malato, il problema è simile alla domanda b del secondo quesito?
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 30 giugno 2012 : 18:48:38
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Ancora il quesito 2.
Al fine della diagnosi, tu vuoi rilevare la presenza di un'inserzione in un gene.
La domanda che ti poni è la seguente:
è tale inserzione presente o meno nel DNA del feto?
La risposta è del tipo SI o NO.
In pratica a te interessa sapere se una sequenza c'è o non c'è, non in che quantità è trascritta. Anche perché, interessando la sequenza codificante e non la regolatrice, puoi supporre che i livelli di trascrizione non siano influenzati. Una semplice PCR è sufficiente.
Se tu disegni i primer di modo che fiancheggino l'inserzione avrai:
- un amplificato "lungo" per gli omozigoti con inserzione
- un amplificato "corto" per gli omozigoti senza inserzione
- un amplificato "corto" ed uno "lungo" per gli eterozigoti.
E così puoi riconoscere le tre situazioni tra di loro...
Se invece avessi un'inserzione, ma non mi sembra questo il caso, che sospetti alterare i livelli di trascrizione di un gene, ti chiederai:
può tale sequenza influire sui livelli di espressione del gene?
E a questo punto userai una RT-PCR quantitativa, comparando i livelli di espressione rilevati a quelli di un individuo privo della mutazione (detto comunemente wild-type) |
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apora88
Nuovo Arrivato
7 Messaggi |
Inserito il - 30 giugno 2012 : 18:53:20
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| Grazie mille veramente! |
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 30 giugno 2012 : 18:55:21
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Prego, ma per qualsiasi chiarimento posta, visto che il mio meessaggio precedente non era riuscito a spiegare chiaramente il ragionamento sotteso alla scelta di una tecnica piuttosto che un'altra.
Better safe than sorry  |
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A Universe From Nothing, Lawrence Krauss
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apora88
Nuovo Arrivato
7 Messaggi |
Inserito il - 30 giugno 2012 : 19:55:24
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per quanto riguarda il primo quesito
una malattia genetica autosomica recessiva è causata dalla delezione del tratto tra il nucleotide -10 e il nucleotide -530 del gene, completamente sequenziato, codificante un enzima coinvolto nella biosintesi delle purine
a) dal punto di vista dell'espressione genica, quale risultato si aspetta da una RT-PCR quantitativa eseguita sull'RNA di una persona portatrice di tale delezione rispetto ad una persona sana?
b) motivi la risposta data alla domanda a).
In questo caso da una RT-PCR quantitativa di una persona sana (non portatrice della delezione) otterremo grandi quantità di amplificato, ma nella persona portatrice della delezione la quantità di amplificato non c'è o è bassa? Sarei più propensa a pensare che non ci sarà amplificato; e dal punto di vista dell'espressione genica, quell'rna codificherà o no quell'enzima? |
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 30 giugno 2012 : 19:59:51
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Tu estrai l'RNA dal campione di cellule, retrotrascrivi (ossia produci da RNA del DNA) e poi amplifichi grazie alla PCR, ricorrendo a primer specifici per il tuo trascritto di interesse.
Se non c'è amplificato, significa che non c'è trascritto.
Se non c'è trascritto, non c'è per definizione espressione del gene.
Mancando le sequenze di riconoscimento per la RNApol, più una buona fetta di altre sequenze regolatorie, non ci sarà trascritto. |
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