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timina89
Nuovo Arrivato

6 Messaggi

Inserito il - 12 dicembre 2013 : 15:16:06

Ciao a tutti sono nuova. A breve avr� l'esame di biologia molecolare e sono un po' in crisi soprattutto per quanto riguarda la normalizzazione della RT-PCR. C'� qualcuno che pu� spiegarmi???

froggyb
Nuovo Arrivato

17 Messaggi

Inserito il - 13 dicembre 2013 : 16:53:40

ciao! dopo aver retro trascritto i campioni di RNA in cDNA, lo step successivo � quello di capire come varia la loro espressione. per capirlo dovrai eseguire delle PCR con i primers dei geni di tuo interesse. Prima per� devi essere certa che la quantit� del tuo campione sia sempre la stessa, quindi per prima cosa fai una PCR usando dei primers per un gene housekeeping. Caricherai su gel il risultato di PCR e dovresti ottenere delle bande della stessa intensit� per tutti i campioni. In caso contrario dovrai ripetere la PCR variando la quantit� di stampo, fino ad ottenere bande della stessa intensit�. Infine userai queste quantit� di cDNA come stampo per i primers dei geni specifici in modo da essere sicuro di aver messo la stessa quantit� di stampo di tutti i campioni. Le bande che rileverai su gel ti dicono la variazione dell'espressione.

Luis 22
Utente

Citt�: Bari

755 Messaggi

Inserito il - 14 dicembre 2013 : 00:17:21

Se intendi la normalizzazione in una Real Time PCR, il tuo obiettivo � rapportare il livello di espressione del tuo gene di interesse rispetto a quello di un gese housekeeping, cio� un gene costitutivo la cui espressione non varia. Solo cos� infatti potrai essere sicuro che le eventuali variazioni di espressione osservate nel tuo gene di interesse saranno effettivamente significative e non dovute ad esempio ad una diversa quantit� di materiale di partenza.
Uno dei metodi per normalizzare nella Real Time PCR � quello di calcolare il Delta Ct, cio� la differenza tra il Ct del tuo gene e il Ct del gene housekeeping.

La vita e i sogni sono fogli di uno stesso libro. Leggerli in ordine � vivere, sfogliarli a caso � sognare. (Arthur Schopenhauer)&

timina89
Nuovo Arrivato

6 Messaggi

Inserito il - 16 dicembre 2013 : 15:33:18

Ok ho capito. Grazie mille e gentilissimi!!!!!