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docale
Nuovo Arrivato
2 Messaggi |
 Inserito il - 19 novembre 2007 : 17:21:28
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ciao a tutti, sono un novello utente quasi laureato in biotec mediche a milano...qualcuno può aiutarmi suggerendomi un protocollo per transfettare cellule COS?grazie siete fighi
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atreliu
Amministratore
Prov.: Milano
Città: Milano
2484 Messaggi |
Inserito il - 19 novembre 2007 : 17:54:38
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 20 novembre 2007 : 01:48:50
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Io ho sempre e solo transfettato cellule COS,
cosa ti serve in particolare? Accorgimenti per la linea cellulare?
Posso solo sconsigliarti di andare oltre la trasnfezione transiente. |
Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
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Aureus
Utente Junior
Prov.: Forlì-Cesena
Città: Gambettola
123 Messaggi |
Inserito il - 20 novembre 2007 : 12:01:37
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Ciao,
ti posso consigliare la trasfezione con Lipofectamine° Plus dell'invitrogen. Si tratta di una trasfezione che avviene attraverso la fusione di lipidi cationici alla membrana. Il protocollo è facile e veloce e la resa alta.
Io ho usato la Lipofectamina 2000 e la Plus,
la Plus ha una resa più alta che la 2000.
Per ora il protocollo non ce l'ho perchè sto usando un computer della biblioteca però non appena mi collego con il mio te lo passo.
A Presto
Ciao
-Lorenzo- |
www.tlbspazio.it
Tecnici di Laboratorio Biomedico
Lorenzo Nardi |
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Aureus
Utente Junior
Prov.: Forlì-Cesena
Città: Gambettola
123 Messaggi |
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Eleo
Nuovo Arrivato
Prov.: Pavia
89 Messaggi |
Inserito il - 20 novembre 2007 : 15:47:22
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questo è il protocollo che ho usato e riusato negli esperimenti di tesi:
• seminare in una piastra Petri per cellule di mammifero da 9 cm di diametro 1,5 milioni di cellule COS7 e incubare a 37° C per tutta la notte per permettere alle cellule di aderire alla superficie di appoggio;
• diluire in una provetta eppendorf 30 #61549;l di FuGENE 6 Reagent (ROCHE) in 600 #61549;l di terreno DMEM senza siero nè antibiotici e lasciare 5 minuti a temperatura ambiente;
• diluire 10 #61549;g di DNA plasmidico in 600 #61549;l di terreno DMEM senza siero nè antibiotici;
• trasferire la diluizione di DNA plasmidico nelle eppendorf contenenti la diluizione di FuGENE e miscelare delicatamente;
• incubare a temperatura ambiente per 15 minuti per consentire la formazione dei complessi tra DNA e agente trasfettante;
• aggiungere la miscela di trasfezione goccia a goccia sulle cellule in coltura e miscelare bene per permettere che tutte le cellule vengano a contatto con l’agente trasfettante;
• incubare le cellule a 37°C per circa 6 ore;
• rimuovere il terreno mediante aspirazione e sostituirlo con terreno completo.
Il rapporto DNA/agente trasfettante varia in un range tra 1:1 a 1:6 ed è bene ottimizzare le condizioni in base alle cellule che si desiderano trasfettare e al DNA che si vuole introdurre.
L'agente trasfettante che ho principalmente usato (protocollo sopra) è il FuGene 6 reagent della roche (ottimo ma costoso) poi ho usato anche Lipofectamine dell'invitrogen (a parere mio il FuGene è meglio, le cellule soffrono di più trattate con lipofectamine) poi ho usato il TransIT L e qualcosa della ditta Mirus (ottima efficienza,relativamente basso costo, protocollo veloce e nessun problema il migiore fra tutti per la trasfezione transiente), non so se è utilizzabile per la trasfezione stabile,dovresti informarti. Per le trasfezioni stabili ho usato il FuGene.
Per quanto riguarda i protocolli ho seguito quelli indicati sul data sheet in linea generale, adattandoli poi al mio caso con opportune modifiche in base al tipo cellulare, alla confluenza, al DNA e al reagente. |
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Aureus
Utente Junior
Prov.: Forlì-Cesena
Città: Gambettola
123 Messaggi |
Inserito il - 25 novembre 2007 : 16:38:41
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LIPOFECTAMINA 2000°
• Le cellule devono essere ad una confluenza dell’80-90%
• Preparare una provetta sterile per ogni campione più una per la Lipofectamina
• Quantificare il DNA e preparare lo schema delle trasfezioni con i relativi volumi da aggiungere.
• Aggiungere ad ogni provetta [1-0,5] #61549;g di DNA. Nella provetta contenente la Lipofectamina si aggiunge solo il terreno.
• Per ogni campione diluire il DNA in 25#61549;l di terreno finali senza siero
• Diluire 1#61549;l di Lipofectamina più 24#61549;l di terreno senza siero per ogni campione in una provetta a parte, è buona norma contare un campione in più per evitare mancanze. Mescolare bene serve per l’efficienza dei vari step.
• Aggiungere ad ogni provetta contenente il DNA e il terreno 25#61549;l del complesso Lipofectamina/Terreno, mescolare bene e incubare per 20 minuti a Temperatura ambiente sotto cappa
• Durante i 20 minuti di incubazione: cambiare il terreno alle cellule, sostituendolo con terreno senza siero (1ml) usando una pipetta sterile.
• Subito prima della fine dei 20 minuti, togliere il terreno da tutti i pozzetti e con la pipetta e aggiungere goccia a goccia,il DNA/Lipofectamina e terreno, sopra alle cellule.
• Incubare 20 minuti sotto cappa a temperatura ambiente basculando la piastra ogni tanto.
• Aggiungere a ogni pozzetto 500ml di terreno completo e 500ml di terreno con siero.
• Riporre la piastra in incubatore a 37°C con CO2 5%.
• Fissare con Metanolo/Acetone 3:1 secondo le proprie esigenze.
http://byfiles.storage.live.com/y1p4UwysB0gI7qCzJIf7F4Beizcu0w6LEr6QkdwJqwzkFJ-9Wm8kAK9jWbm5qDO5bzyhGlBLgJgsb4
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www.tlbspazio.it
Tecnici di Laboratorio Biomedico
Lorenzo Nardi |
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manux86
Nuovo Arrivato
1 Messaggi |
Inserito il - 13 aprile 2012 : 15:44:02
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| Ciao a tutti, sono una dottoranda al primo anno, devo scrivere un progetto e volevo sapere se qualcuno di voi conosce il nome di linee cellulari neuronali che possono essere trasfettate in modo inducibile o microiniettate. |
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Transfettare cellule COS [Era:help!!!]
Didattica
