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 end point PCR con primers taqman
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Loraia
Nuovo Arrivato



13 Messaggi

Inserito il - 01 ottobre 2013 : 14:57:20  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Loraia Invia a Loraia un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao a tutti!
ho un "piccolo" problema con la pcr...
la mia supervisor ha avuto la brillante idea di chiedermi di fare un esperimento simile a uno trovato in un paper...facendo breve dovrei fare una qPCR su DNA genomico (a loro e' riuscito quindi io non dovrei avere problemi,in teoria....).
abbiamo ordinato i primers per la luc indicati nel paper e per vedere se funzionavano ho fatto una end point e il risultato faceva a dir poco piangere...dopo averci provato altre 3 volte il risultato non cambiava...cosi ho inserito la mia sequenza in primers3 e i miei primer e e' venuto fuori che il riverse era troppo corto, ordinato il nuovo set di primers ho fatto un'altra end point ma il risultato e' da crisi isterica cmq.....
secondo voi il fatto che le sonde sono taqman interferisce con la end point?aiutoooooo non so più che fare!!!!!!!

grazie mille!!!

picchiasebino
Nuovo Arrivato


Città: roma


52 Messaggi

Inserito il - 03 ottobre 2013 : 09:46:18  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di picchiasebino Invia a picchiasebino un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao. difficile rispondere... le sonde taqman vanno benissimo con le end point come per la qPCR.
Secondo me devi controllare molto bene nel paper i materiali e metodi. Sequenze dei primer, sequenza sonda e che tipo di quencher e reporter, profilo termico, mastermix usata o componenti separati, e soprattutto concentrazioni e volumi dei reagenti utilizzati. Naturalmente anche il DNA genomico dovrà essere di buona qualità e a concentrazione nota.
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8380 Messaggi

Inserito il - 03 ottobre 2013 : 17:28:07  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando

Mi spiegate una sonda taqman come fa a funzionare in una end-point?
O meglio per funzionare funziona anche ma... senza un sistema di rivelazione come si fa a vedere la fluorescenza emessa?




Comunque... non so di preciso cosa tu abbia messo nella tua PCR end-point:
- se hai messo anche la sonda l'hai messa inutilmente perché tanto non hai modo di visualizzarla
- se hai messo solo i primers (cosa giusta da fare) è molto plausibile che comunque in una end-point tu veda altri frammenti oltre a quello che ti interessa perché la "specificità" in real-time è data dalla presenza della sonda! (che non hai o comunque non vedi in una end-point)
Quindi in real-time vedi l'amplificazione specifica del tuo frammento, mentre nella end-point vedi tutti i frammenti che si possono amplificare con quei primers!
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Loraia
Nuovo Arrivato



13 Messaggi

Inserito il - 03 ottobre 2013 : 18:06:20  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Loraia Invia a Loraia un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
allora nella end-point ho messo gotaq flexi buffer, MgCl2,PCR Nucleotide Mix,GoTaq DNA Polymerase,DNA, Nuclease-Free Water...al posto di upstream primer e downstream primer ho messo i primers che dovrei usare per la real-time, che sono probes e primers premixati....
le condizioni di amplificazione sono quelle ottimali per la taq, ho solo cambito la temperatura di annealing mettendo quella ottimale dei miei primers (che rientra cmq nel range di quelle consigliate per la taq)...
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8380 Messaggi

Inserito il - 03 ottobre 2013 : 18:25:33  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Sì beh le considerazioni rimangono le stesse che ho fatto prima!
Nella tua reazione hai anche la sonda che farà il suo lavoro, ma dato che quello che vai a vedere non è la fluorescenza ma sono i frammenti amplificati visualizzati su un gel, vedrai anche altri frammenti che possono essere amplificati con quei primers.
L'unica cosa che puoi fare è cambiare le condizioni di PCR per renderle più stringenti e vedere se così hai meno amplificati, ma ripeto in ogni caso la specificità è data dalla sonda che "funziona" solo in real-time.
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picchiasebino
Nuovo Arrivato


Città: roma


52 Messaggi

Inserito il - 03 ottobre 2013 : 20:43:54  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di picchiasebino Invia a picchiasebino un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao GFPina, ma nel primo post di Loraia dove è che cita il gel...?
Per me era chiaro che si trattasse di una end-point in realtime. Scusate se ho confuso le idee.

Citazione:
Messaggio inserito da GFPina


Mi spiegate una sonda taqman come fa a funzionare in una end-point?
O meglio per funzionare funziona anche ma... senza un sistema di rivelazione come si fa a vedere la fluorescenza emessa?




Comunque... non so di preciso cosa tu abbia messo nella tua PCR end-point:
- se hai messo anche la sonda l'hai messa inutilmente perché tanto non hai modo di visualizzarla
- se hai messo solo i primers (cosa giusta da fare) è molto plausibile che comunque in una end-point tu veda altri frammenti oltre a quello che ti interessa perché la "specificità" in real-time è data dalla presenza della sonda! (che non hai o comunque non vedi in una end-point)
Quindi in real-time vedi l'amplificazione specifica del tuo frammento, mentre nella end-point vedi tutti i frammenti che si possono amplificare con quei primers!

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chick80
Moderatore

DNA

Città: Edinburgh


11491 Messaggi

Inserito il - 03 ottobre 2013 : 20:55:58  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Hmmmm in generale per "end-point" si intende la PCR tradizionale in cui vedi il risultato su gel, per distinguerla appunto dalla real-time.

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picchiasebino
Nuovo Arrivato


Città: roma


52 Messaggi

Inserito il - 03 ottobre 2013 : 21:50:55  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di picchiasebino Invia a picchiasebino un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Grazie della precisazione. Per end point ho sempre considerato che fosse una Pcr qualitativa indipendentemente se fosse fatta su gel o in real-time.

Citazione:
Messaggio inserito da chick80

Hmmmm in generale per "end-point" si intende la PCR tradizionale in cui vedi il risultato su gel, per distinguerla appunto dalla real-time.

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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8380 Messaggi

Inserito il - 03 ottobre 2013 : 23:20:43  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Sì, anche se "PCR end-point" letteralmente non significa altro che la PCR al "punto finale", quindi "vista" alla fase di plateau viene intesa appunto quella visualizzata su gel, in contrapposizione appunto alla "real-time" come dice chick80. Quindi non mi sono proprio posta il problema che si potesse intendere qualcosa di diverso.
Inoltre se si vogliono provare i primers da usare in una real time, in genere si usa appunto una end-point con visualizzazione su gel per vedere se amplificano la banda corretta. Di fare una "qualitativa" andando a leggere la fluorescenza all'end-point in questo caso non ne capirei proprio il motivo.

Comunque forse Loraia dovrebbe spiegarci meglio, dicendo bene qual é il risultato che ha ottenuto, piú che dire che "é da panico".
Detto questo, se il problema sono gli "aspecifici" su gel non é detto che non funzioni comunque in real-time dove entrerebbe in gioco anche la sonda.
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