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paolaberna
Nuovo Arrivato



5 Messaggi

Inserito il - 13 agosto 2008 : 12:09:55  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di paolaberna Invia a paolaberna un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao a tutti...
secondo voi è possibile amplificare un prodotto di PCR con gli stessi primer usati nella prima PCR. In poche parole faccio una PCR ed ottengo un amplificato (una sola banda quella attesa). Se io faccio poi una seconda PCR partendo da questo amplificato con gli stessi primer ho possibilità di amplificare nuovamente il frammento? in caso devo cambiare qualche condizione di PCR?
Grazie a tutti
Paola

chick80
Moderatore

DNA

Città: Edinburgh


11491 Messaggi

Inserito il - 13 agosto 2008 : 12:42:34  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ci potrebbero essere dei problemi perchè i primer ora si legheranno proprio sulle estremità del template, e il legame potrebbe essere meno stabile. Comunque potrebbe anche funzionare, mai provato.

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Schuldiner86
Utente Junior

Biotech

Prov.: Viterbo
Città: Bologna


581 Messaggi

Inserito il - 13 agosto 2008 : 12:56:32  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Schuldiner86  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Schuldiner86  Invia a Schuldiner86 un messaggio Yahoo! Invia a Schuldiner86 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Perché non provi con una nested pcr? prendi prima primers più esterni alla sequenza di tuo interesse e nella seconda pcr usi i primers specifici per la tua sequenza...



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Ayla
Utente Junior

guardiano

Città: Wageningen


573 Messaggi

Inserito il - 13 agosto 2008 : 13:20:51  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Ayla Invia a Ayla un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
secondo me funziona, ricordo di averlo fatto una volta. In ogni caso prova, e all'inizio non cambiare le condizioni.
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antonella85
Nuovo Arrivato


Città: Firenze


15 Messaggi

Inserito il - 13 agosto 2008 : 14:36:41  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di antonella85 Invia a antonella85 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
il risultato potrebbe non essere ottimale... generalmente si disegnano i primers in modo che essi si appaino distanti (circa una ventina di basi) a monte e a valle rispetto alla sequenza da amplificare... concordo con Schuldiner86, potresti provare con una nested...
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8397 Messaggi

Inserito il - 13 agosto 2008 : 15:29:31  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Si può fare, io lo fatto alcune volte perchè avevo esigenze particolari, per cui una nested non era adeguata.
Comunque ogni reazione di PCR è un caso a se, quindi come ti è già stato detto parti dalle stesse condizioni che hai utilizzato per il primo amplificato e poi nel caso modificale se ci dovessero essere dei problemi! L'unica cosa che ti consiglio di fare è di diluire l'amplificato precedente (come si fa anche per le nested), prova a fare diverse diluizioni.

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Patrizio
Moderatore

mago

Città: Vancouver


1900 Messaggi

Inserito il - 13 agosto 2008 : 15:54:11  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Patrizio  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Patrizio Invia a Patrizio un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
anch io l ho fatto....perche' anche le mie erano esigenze particolari,ma se la banda ce l hai,perche'devi rifare la PCR sullo stesso amplificato? ..concordo con GFPina per quanto riguarda le diluizioni ,l anniling non dovrebbe variare

e poi ... MA VOI SIETE GIA' OPERATIVI?????? io sono al mare un giorno si e l altro pure ....


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