Estrazione di RNA da tessuto adiposo-osso
Descrizione
Questa tecnica serve per l'estrazione di RNA da tessuto adiposo, osso, muscolo o cervello mediante l'utilizzo di colonnine QIAGEN.
In una provetta da 5ml in polipropilene mettere 1m di QIAzol
Lysis Reagent della ditta QIAGEN.
Pesare il pezzo di tessuto congelato, che non dovrà superare i 100mg (per il tessuto adiposo occorrono invece non meno di 100mg, meglio se 200mg), tenendolo in azoto liquido per evitare assolutamente lo scongelamento. Inserire il pezzo sempre congelato nel QIAzol.Potterizzare il pezzo, ovvero frullarlo con un apposito omogeinizzatore sotto cappa. Se si hanno più campioni lavare la fresa con acqua, poi SDS 1%, poi alcool etilico 96%, infine acqua e avvinamento della fresa con QIAzol ( usare delle falcon da 25 ml), prima di passare ad un altro campione.Consiglio
Fare attenzione che non ci siano pezzettini di tessuto all'interno della fresa.
Consiglio
Per l'osso: pestarlo fino a polverizzarlo, in un mortaio che va tenuto in azoto liquido, prima di potterizzarlo.
Omogeneizzare il campione fino a completa disgregazione del pezzo, i tempi variano a seconda del tipo di tessuto: da 20-40 secondi per il tessuto adiposo a qualche minuto per l'osso.Lasciare il materiale potterizzato per 5minuti a T° ambiente.Trasferire il tutto in una eppendorf da 2ml ed aggiungere 200microl di cloroformio, agitare per 15 sec. vigorosamente senza vortexare.Lasciare 2-3 min. a T° ambiente.Centrifugare a 12000 g per 15 min. a 4°CPrelevare il surnatante, che sarà all'incirca 600microl trasferirlo in una eppendorf da 1.5microl ed aggiungere ugual volume (600microl) di etanolo 70%. Agitare bene, non vortexare e non centrifugare.Pipettare 700 µl, compreso eventuale precipitato formatosi, nelle apposite colonnine dell'RNeasy Mini Kit.
Centrifugare a 10000 rpm per 15 sec. a T° amb., gettare ciò che fuoriesce nell'apposito smaltimento rifiuti per solventi del laboratorio.Ripetere lo step sopra descritto.Aggiungere 700microl di Buffer RW1 in colonna e centrifugare a 10000 rpm per 15 sec. a T° amb., gettare ciò che fuoriesce.Mettere la colonna in un nuovo tubo da 2ml e pipettare 500microl di Buffer RPE in colonna, quindi centrifugare a 10000 rpm per 15 sec. a T° amb.Fare un secondo lavaggio con altri 500microl di Buffer RPE a 10000rpm per 2 min a T° amb.Fare un'ulteriore centrifugata mettendo un tubo nuovo alla massima potenza della centrifuga per 1 min. a T° amb., poi con una pipetta da 10microl prelevare l'eventuale liquido di lavaggio rimasto sull'oring posto attorno al filtro-membrana, facendo ben attenzione a non toccare il filtro.Trasferire la colonna in un tubo sterile (nel quale verrà conservato l'RNA) da 1.5microl. Pipettare 40microl di acqua RNasy-free direttamente sul filtro-membrana, evitando di toccarlo con la punta del puntale e centrifugare a 10000rpm per 1min a T° amb.Ripetere lo step sopra descritto ripescando i 40microl fuoriusciti dal tubo e rimettendoli in colonna.Leggere l'assorbanza allo spettrofotometro e quindi determinarne la quantità e la purezza (a 260nm il range ottimale sarà tra 0.150 e 1.5 a 280nm il rapporto ottimale sarà tra 1.8 e 2 a 230nm vado a leggere eventuali contaminazioni da sostanze organiche); per quanto riguarda la qualità bisogna fare una corsa elettroforetica con dei chip particolari in strumenti particolari come ad esempio il BIOANALYZER dell' Agilent
