Batteri Competenti (metodo del CaCl2)
Descrizione
Classico protocollo per ottenere cellule competenti per trasformazione via Heat Shock.
Crescere un inoculo di cellule ON in 3 ml di LB, a 37°C (o a 30°C a seconda del ceppo)Diluire il precedente inoculo in 300 ml di LBCrescere a 37°C ( o 30°C ) fino a OD600=0.6Incubare le cellule in ghiaccio per 10 min. Suddividere in falcon da 50 ml.Centrifugare a 3000 rpm per 10 min a 4°C, scartare il surnatante.Risospendere le cellule, delicatamente tenendole in ghiaccio, con 0.5 ml di 100 mM CaCl2, aggiungere 20ml di 100 mM CaCl2Incubare in ghiaccio per 20 min.Centrifugare a 3000 rpm per 10 min a 4°C, scartare il surnatanteRisospendere le cellule, delicatamente tenendole in ghiaccio, con 0.5 ml di 100 mM CaCl2, aggiungere 4 ml di 100 mM CaCl2Incubare a temperatura ambiente 20 min.Centrifugare 10 min a 3000 rpm.Risospendere il pellet a 0.5 ml di 100 mM CaCl2 e aggiungere 0.12 ml di glicerolo 50%.Congelare in Azoto liquido o ghiaccio secco ed Etanolo.Conservare a –80 °C.Consiglio
Utilizzare materiale sterile, preraffreddare il materiale plastico e la soluzione a 4°C.
PASSAGGIO IMPORTANTE
Le cellule rese competenti sono particolarmente sensibili, trattarle con delicatezza.