Diversamente dalla classica conta in camera di Burker, la camera NEUBAUER improved si propone di ottimizzare i tempi della conta infatti, vista al MO, essa è formata da soli 4 quadrati grandi delimitati da linee triple, ognuno dei quali formato da ulteriori 16 quadrati più piccoli. Noi andremo a contare le cellule contenute nei 4 quadrati grandi più quelle presenti su due lati contigui di ogni quadrato (la scelta dei lati contigui è SOGGETTIVA).
La conta delle cellule viene effettuata con Trypan Blue, colorante delle cellule morte.



Per ottimizzare i tempi, prima di prelevare le nostre cellule, prepariamoci una MULTIWELL da 96 e, stabilito un fattore di diluizione (F= fattore, D= diluizione) di 1:10, in un volume finale (V= volume, F= finale) di 100ul avremo:
- Trypan Blue: 90ul
- Sospensione cellulare: 10ul
A questo punto possiamo prelevare la nostra sospensione cellulare, dopo adeguata sospensione, e poniamo poche decine di µlitri* in un pozzetto della multiwell preparata in precedenza.
Ricordatevi di controllare sempre il VF della vostra sospensione prima di prelevare l'aliquota per la conta!
Con una P100 preleviamo 90ul di Trypan e li poniamo in un pozzetto della multiwell (accanto o sopra a quello contenente la sospensione); con una P20 preleviamo 10ul dal pozzetto contenente la sospensione cellulare e li diluiamo nel pozzetto contenente il Trypan. Dopo una lenta e ripetuta sospensione preleviamo un'aliquota (di solito ne prelevo 10ul) e li poniamo nella camera di conta.

Effettuata la conta come sopra descritto, il numero di cellule per ml e il totale di cellule si ottiene secondo le seguenti formule:

- cc/ml= A+B+C+D/4 x 10^4** x 10

- ccTOT= cc/ml x VF

E' possibile, inoltre, calcolare la vitalità cellulare (V):

V= N° di cell. vive/N° di cell. vive + N° di cell. morte

NOTE:
*:dopo aver prelevato il contenuto di una PETRI e posta in FALCON, passo alla centrifugazione. In base al pellet ottenuto aggiungo n ml di terreno. Sospendo per bene il tutto e, alla fine, lascio nella pipetta poche decine di ul. Porto la pipetta fuori cappa e la vuoto nel pozzetto della multiwell che avevo preparato in precedenza.
**:il valore 10^4 si riferisce al FD della camera di conta NEUBAUER (0,100mm)