Purificazione dei corpi elementari delle clamidie

Descrizione

Per testare l'azione di un farmaco sulle clamidie (sulle varie specie costituenti la famiglia delle Chlamydiacee) necessario purificare,ovvero estrarre, i corpi elementari delle clamidie poich sono essi ad avere potere infettante. Si pu, quindi, procedere per determinare lattivit dei farmaci nei confronti delle clamidie valutando la MIC e la MBC in base alla loro azione sul ciclo di replicazione intracellulare delle clamidie.

Purificazione dei corpi elementari delle clamidie.
Il ceppo di clamidie fatto crescere in monostrati cellulari dei tubini, stato passato da questi nei monostrati cellulari di 30 piastre a 6 pozzetti del diametro di 3,5 cm, centrifugato a 2000 rpm per 2 ore a 33C e successivamente posto ad incubare a 37C per 48-72 ore. Successivamente, i CE delle clamidie sono stati purificati usando gradienti di saccarosio seguendo la metodica di Tamura e Higashi (Tamura A. et al., 1963)46 con alcune modifiche (Fukushi e Hirai, 1988)47. Le cellule infettate con le clamidie, sono state staccate con rubber, raccolte in provette coniche da 50 ml e sottoposte a sonicazione per 3 cicli di 10 secondi ciascuno, con un sonicatore Bandelin alla minima potenza e quindi centrifugate a 3000 rpm per 10 minuti a 4C; il sovranatante, contenente le clamidie, stato ultracentrifugato a 18000 rpm per 35 minuti a 4C con il rotore SW27 per ultracentrifuga Beckman. Successivamente, il pellet stato sospeso in 40 ml di TRIS 0.01M pH 7.4, sonicato 3 volte per 10 secondi e suddiviso in due provette contenenti un cuscino di saccarosio al 30% (peso/peso)in TRIS 0.01M pH 7.4. In seguito ad ultracentrifugazione a 18000 rpm per 45 minuti a 4C, il pellet di ciascuna delle due provette stato sospeso in 2 ml di TRIS, sonicato 2 volte per 10 secondi e stratificato con pipetta Pasteur su un gradiente continuo di saccarosio 30-60% (peso/peso). Dopo centrifugazione a 18000 rpm per 1 ora a 4C, la banda dei CE, presente a circa met altezza di ciascuna delle due provette, stata raccolta con siringa con ago lungo 8 cm e risospesa in TRIS. Il pellet ottenuto dopo centrifugazione a 18000 rpm per 35 minuti e contenente i CE purificati delle clamidie, stato sospeso in circa 300 l di saccarosio-fosfato- acido glutammico (SPG) 0.2M e congelato fino al momento delluso a -70C, dopo la sua ripartizione in piccole aliquote.