I plasmidi sono introdotti in E.coli come DNA nudo: metto a contatto cellule di E.coli rese competenti con plasmidi ottenuti in vitro. Per fare diventare le cellule competenti ci sono una serie di protocolli sperimentali che prevedono l'utilizzo di ioni bivalenti (CaCl₂), altri metodi non di routine per E.coli prevedono l'elettroporazione(utilizzo più ampio in eucarioti): brevi scariche elettriche favoriscono l'uptake del plasmide.
Una volta rese le cellule competenti il DNA può essere introdotto incubando le cellule con la soluzione di DNA plasmidico (il batterio ora è trasformato).

Per assicurarmi che le cellule siano trasformate, piastro terreni selettivi: ad esempio posso mettere una resistenza alla ampicillina nel plasmide e piastrare su un terreno con quell'antibiotico: solo le cellule trasformate sopravviveranno.
Una volta individuata una colonia che possiede il plasmide posso farla crescere su terreno liquido, per avere grandi quantità del plasmide (che devo studiare, sequenziare o usare..)
Altri vettori utilizzati per E.coli sono i fagi. Posso introdurre sia DNA nudo che DNA ricostruito (all'interno della particella fagica).
P er l'introduzione di DNA nudo rendo le cellule competenti (come prima), ed utilizzo il fago come vettore. In questo caso farò cresciere una patina uniforme di batterio, sulla quale mettero i miei fagi (o distribuisco uniformemente sull'intera piastra una soluzione di batteri e fagi), al posto di colonie troverò delle placche dovute alla lisi causata dal ciclo litico del fago.
I vantaggi rispetto al plasmide sono fondamentalmente la possibilità di clonare frammenti di dimensione maggiore. Se con i plasmidi arrivavo a 15 kbp, con i fagi posso usare frammenti più grandi: permettono quindi uno screening su grandi numeri.
Di seguito osservazioni sul fago come vettore, non come organismo.

FAGO LAMBDA.
Permette il clonaggio di frammenti. fino a 20 kb.
Ha una testa icosaedrica, all'interno della quale c'è il DNA lineare impaccato, e una coda, i cui costituenti sono codificati dai geni del fago.
Schematicamente il DNA fagico (per un totale di 48500 bp) è così:

|-ORI-|- lisi -|-- lisogenia --|-- proteine testa/coda --|-- terminasi --|

In più abbiamo la zona tra 20 e 38 kb e a livello di 42 ci sono i geni necessari per il processo lisogeno.
Le estremità sono estremità coesive, perché sono presenti i geni cos (12 bp). Durante il ciclo vitale il genoma lo possiamo trovare sotto diverse forme:
Esiste anche nella forma circolare. Durante l'infezione al batterio il DNA fagico viene introdotto dal virus come lineare. Per le estremita cos, il filamento di DNA si circolarizza, ed i nick rimanenti vengono chiusi da E.coli. Questo rappresenta l'intermedio sia per la replicazione sia per l'integrazione. Quando si integra, l'integrazione avviene in punti specifici che avvengono a seconda del fago. Non avviene a livello del sito cos, ma in posizione sfalsata, quindi integrato il DNA è permutato rispetto a quello che troviamo nella testa (i geni sono quelli ma l'ordine è diverso).
Esiste anche sottoforma di concatenameri: unità ripetute nel genoma saldate a livello dei siti cos, questi si formano perché all'interno della cellula la forma circolare si replica secondo il modello "rolling-circle": si forma un nick, la parte interna funge da stampo su cui viene sintetizzato il secondo strand. Man mano che viene sintetizzato si ha l'estrusione dello strand, man mano che il single strand viene estruso interviene l'RNA (che funge da primer e poi è eliminato) eccetera e si forma il secondo (-> concatameri).
Nella replicazione del virus, il concatenamero viene introdotto all'interno delle teste vuote. Una volta introdotto il pezzo che serve (fino all'estremità cos) interviene la terminasi (sintetizzata contemporaneamente) che riconosce, si lega e taglia a livello dei siti cos. Quello che entra è quindi DNA ds lineare. Una volta entrato il dna, il packaging virale si completa, attaccandosi anche la coda.
Esiste un vincolo di dimensioni per quanto riguarda l'impaccamento del DNA all'interno della testa: il genoma non deve essere più piccolo di 38 kb e non deve essere più grande di 52 kb. Le dimensioni medie sono 50.

Partendo dal genoma come abbiamo visto, i geni per la lisogenia sono stati eliminati, mentre si lascia una zona dove sono inseriti siti unici o siti di clonaggio. Per avere il mio vettore devo tagliare il DNA fagico lineare, aggiungere la sequenza da clonare, con dimensioni in funzione della lunghezza totale che deve essere di 52Kb (al max 20 kb di frammento quindi), aggiungere la ligasi e ottenere il rDNA (elemento extracromosomale).

Poiché i siti cos sono complementari in realtà quello che si forma nella mix dei ligandi è una miscela: posso avere tutte le possibili formazioni: La ligasi, come agisce su Eco agisce su cos, quindi ho una mix di concatameri più o meno lunghi e con più o meno possibilità di riarrangiamento.

_cos-----^Eco  (_Eco----^Eco)_{n  Eco}-------^cos

Anche qua tutti i riarrangiamenti saranno impaccati se le dimensioni sono quelle giuste. Prima di arrivare all'impaccamento posso introdurre dei marcatori che mi permettano di  selezionare quello che mi interessa rispetto al DNA originale. Se io taglio i geni per la lisogenia e ci metto lacZ, infettando E.coli con il fago che porta questo DNA e che piastro in presenza di Xgal, le placche di lisi saranno blu. Se all'estremità ci metto un polilinker, questo mi permette di clonare all'interno di lacZ, quindi le placche trasformate ricombinanti saranno bianche. Questo perché nella soluzione di ligazione si può formare anche il DNA  wild-type, se non elimino il frammento originale dove ho clonato.
Ovviamente poi vado ad analizzare il DNA, perché fra tutti i possibili impaccamenti ottenuti qualcuno può anche non interessarmi. Inoltre questo è il caso peggiore: se uso 2 enzimi che non lasciano estremità compatibili riduco le possibilità.
Poichè il mio virus sarà privato di tutte le regioni codificanti per le proteine, ho bisogno di avere code e teste vuote, con la quale far fare poi il packaging. Si utilizzano così due ceppi di E.coli che vengono infettati con 2 fagi mutanti: uno è infettato con un fago mutato nel gene per la terminasi, l'altro lo infetto con un fago mutato nel gene della testa. In entrambi inì casi, in queste condizioni, una volta che io ho infettato, non avrò produzione di particelle fagiche: nel primo caso ho teste vuote, code e DNA impossibilitato nell'impaccamento; nell'altro caso avrò la terminasi (enzima che taglia i concatenameri nel momento del packagin), le code ma sarò senza teste. Ci sono metodi che permettono di isolare i prodotti e di eliminare il DNA che non è stato impaccato: mettendo insieme le due soluzioni contenenti le componenti struttrali e enzimatiche virali, con il mio DNA fagico costruito ho il packaging: il DNA fagico entra nelle teste, la terminasi taglia a livello delle zone cos e ottengo particelle fagiche ricombinanti che userò per infettare cellule di E.coli.

FAGO M13.
Rispetto a lambda, siccome non ha vincoli di impaccamanto riguardo le dimensioni, permette il clonaggio di frammenti più grandi. È un fago bastoncellare, il suo DNA è  circolare single strand, e molto più piccolo: 6400 nucleotidi. Infetta solamente cellule di E.coli F+, attraverso il pilus F, al quale si lega e penetra all'interno della cellula.
Il ciclo vitale è ancora più complesso, schematicamente, infetta le cellule, entra DNA circolare ss che è subito trasformato in ds. Il quale, la prima cosa che fa è replicare 300 copie di se stesso.
I 300 ds dirigono da una parte la sintesi di proteine per la costruzione dei fagi (capside etc) dall'altro dirigono la sintesi del DNA, sempre con il rolling circle. La differenza è nelle modalità: l'inizio è uguale, ma non si forma il concatenamero double, all'interno di E.coli ho ds che dirige e ss che poi verrà estruso e, rivestito dalle proteine del capside, verrà rilasciato all'esterno senza causare la lisi dell'ospite. È vero che a E.coli 300 particelle di esoDNA non è che facciano poi così bene, ma l'unico risultato evidente è il rallentamento della crescita.
Come punto di partenza viene estratto il DNA ds all'interno delle cellule infettate (gli enzimi di restrizione non tagliano il ss). Anche qui si modificano i geni che non interessano per prendere spazio. Ci butto dentro LacZ e clono al suo interno. Con questo DNA circolare ricombinante trasformo (in fondo è un plasmide) cellule di E.coli, cosicchè, quando potrà, questa forma replicativa andrà incontro alla amplificazione e rilasciando ss sottoforma di fagi.
Il tutto senza limiti di dimensioni e senza lisi cellulare e con la possibilità di disporre DNA ss e ds.
Inoltre, siccome è ss, la mia modifica suibisce un orientamento:
|---->>>>>>>>>>----|  oppure  |----<<<<<<<<<<<-----|, avrò particelle fagiche con ss di un'elica o dell'altra.

Sfruttando le caratteristiche e i vantaggi di plasmidi e fagi sono nati Cosmidi, Fasmidi, BAC e PAC.