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-5° giorno-
Analisi risultati e preparazione minicolture

Poichè la trasformazione delle cellule preparate dal gruppo è stata svolta con una quantità di DNA plasmidico non saturante, si può procedere al calcolo dell'efficienza di trasformazione:
Efficienza trasformazione = ° colonie resistenti all'Amp / ug DNA plasmidico

Protocollo:

Preparazione all'analisi dei plasmidi ricombinanti:

  • Scelta di 2 cloni bianchi (contenti l'inserto, e resistenti all'Amp)
  • Prelievo sterile da clni isolati con ansa sterile, e inoculo di 5ml di terreno LB+Amp
  • Incubazione a 37°C
  • Preparazione di gel d'agarosio per il giorno dopo

Note, risultati e conclusioni:
Come aspettato nella piastra in cui non era stato messo DNA non si è osservata alcuna crescita, essendo il terreno contenente ampicillina ed il gene per la resistenza all'antibiotico sul plasmide. Nella piastra con il plasmide chiuso i frammenti alfa, sul plasmide, e omega, sul menoma batterico, hanno permesso di ottenere una beta galattosidasi funzionante la quale, reagendo con l'X-gal ha reso le colonie colorate di blu. La sintesi della beta galattosidasi è permessa dall'induttore dell'operone LAC IPTG messo nel terreno. In particolare l'induttore si lega al repressore dell'operone, rendendo così la produzione di beta galattosidasi costitutivamente espressa.
Nella piastra contenente il prodotto della ligazione dal vettore linearizzato si osserva una mediocre crescita. In questo modo possiamo testare l'enzima ligasi usato.
Poiché la fosfatasi alcalina non è efficiente al 100% si osserva la presenza di cloni anche nella piastra il cui prodotto di ligazione era stato il vettore defosforilato e linearizzato.
Nella piastra in cui non vi erano state messe le cellule trasformate con il prodotto di ligazione tra il vettore defosforilato ed il frammento si osserva la presenza di colonie bianche, in quanto il frammento rende la beta galattosidasi inattiva.


Risultato della trasformazione


 
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