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elving
Utente Junior



240 Messaggi

Inserito il - 02 luglio 2009 : 18:40:10  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di elving Invia a elving un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ho letto ovunque che è un ibrido tra FISH e PCR, ma non capisco come funziona!!
aiuto...lunedì ho l'esame!!

chick80
Moderatore

DNA

Città: Edinburgh


11491 Messaggi

Inserito il - 02 luglio 2009 : 19:48:15  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Prova a vedere l'articolo originale in cui descrivono la tecnica:
Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation-dependent probe amplification.

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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8408 Messaggi

Inserito il - 02 luglio 2009 : 20:46:06  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Se utilizzi la funzione cerca del forum troverai altre discussioni al riguardo, ad es. ti consiglio queste due:
http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=5943
http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=4637

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elving
Utente Junior



240 Messaggi

Inserito il - 02 luglio 2009 : 21:04:32  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di elving Invia a elving un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
la funzione cerca l'ho usata, ma non capisco ancora che utilità abbia...perchè usare due sonde che vengono poi unite invece che una sola?
in pratica è una PCR con un primer molto lungo, formato da due sonde che si legano insieme??
dicono che ha anoalogie con la FISH..in pratica ha sono i fluorocromi di analogo, poi è tutto differente..o sbaglio?
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8408 Messaggi

Inserito il - 02 luglio 2009 : 23:50:33  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Beh mi sembrava spiegato bene nel primo link e dalle figure del lavoro indicato da chick80.

Citazione:
ma non capisco ancora che utilità abbia...perchè usare due sonde che vengono poi unite invece che una sola?

Comunque con usa solo sonda non funzionerebbe!
Tutto il metodo è basato sul fatto che le due sonde vengono legate dalla ligasi.
Poi con una sonda sola dovrebbero essere tutte di lunghezza diversa per discriminare in base al peso, e questo creerebbe problemi all'appaiamento, non avrebbero tutte la stessa Tm.

Citazione:
in pratica è una PCR con un primer molto lungo, formato da due sonde che si legano insieme??

no è una delle 2 sonde che è molto lunga!
Le due sonde legate assieme non sono il primer ma lo stampo su cui avviene la PCR, i primers si appaiano alle code delle sonde, la parte finale che non si appaia con il gene.
chick80 è stato anche a fare il disegnino nell'altro post (che copio spudoratamente! )



 P1                ---P2                P1              ---P2       P1                 ---P2 
   \              /                       \            /              \               /
    aaaaaa aaaaaaa                         bbbbb bbbbbb                ccccccc ccccccc
----AAAAAAAAAAAAAA-------------------------BBBBBBBBBBBB----------------CCCCCCCCCCCCCCC------

quelli indicati con P1 e P2 sono le sequenze della sonda a cui si appaieranno i primers.

Citazione:
dicono che ha anoalogie con la FISH..in pratica ha sono i fluorocromi di analogo, poi è tutto differente..o sbaglio?

beh hai sempre una sonda che si appaia e che però non è marcata, ma è uno dei primer ad essere marcato, poi il resto è fatto con la PCR.

Ma più che cercare le analogie credo che sia importante che tu capisca come funziona la tecnica.

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elving
Utente Junior



240 Messaggi

Inserito il - 03 luglio 2009 : 00:27:58  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di elving Invia a elving un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
grazie...mi era sfuggita la parte delle code ce non si appaiano con il gene!!
non avevo capito proprio niente...sarà che non dormo da una settimana per questo maledetto esame...decine di sindromi e molte più tecniche...

comunque, per la storia della marcatura, nel mio libro c'è scritto che sono i nucleotidi ad essere marcati. ma magari queste cose variano da protocollo a protocollo...

quindi, ricapitolando:
ho due sonde che si appaiano molto vicine, le cui estremità prossimali non sono complementari al gene e quindi restano libere.
sempre durante la fase di annealing, a queste due codine si legano i primers, mentre la ligasi salda le due sonde.
poi si ha una PCR normale che usa l'oligo prodotto dall'unione delle due sonde come stampo.

spero di averci azzeccato sta volta...
ma vedi un po' tu..che brutta figura che ho fatto!!
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elving
Utente Junior



240 Messaggi

Inserito il - 03 luglio 2009 : 00:36:16  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di elving Invia a elving un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
non avrebbero tutte la stessa Tm

aspetta..quindi tutte le sonde sono uguali come lunghezza e siili come rapporto AT/CG, giusto?
quindi può capitare che le due sonde vanno ad appaiarsi leggermente distanti tra loro, tipo 3-4 nucleotidi?
...
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