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liven
Nuovo Arrivato
Città: Roma
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 Inserito il - 05 novembre 2008 : 18:03:18
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Salve a tutti,
ho iniziato recentemente a coltivare colture primarie di neuroni di ratto, in particolare neuroni corticali e di ippocampo. Ho notato che dopo la procedura di tripsinizzazione, entrambi i tipi di neuroni sono avvolti da una specie di liquido viscoso (simile a quello formato dal dna dopo una lisi nucleare in ripa buffer).
La domanda è la seguente: è un problema mio o è effettivamente una cosa che capita? E' se capita, quale è la natura di tale pappetta e come si può eliminare?
Grazie
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Liven
"Pillola azzurra, fine della storia: domani ti sveglierai in camera tua e crederai a quello che vorrai. Pillola rossa: resti nel paese delle meraviglie e vedrai quant’ é profonda la tana del bianconiglio…" |
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elly_
Utente Junior
400 Messaggi |
Inserito il - 05 novembre 2008 : 18:33:06
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| le cellule sono ben separate o tendono a formare aggregati? poi, che substrato usi per l'adesione delle cellule? |
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liven
Nuovo Arrivato
Città: Roma
15 Messaggi |
Inserito il - 05 novembre 2008 : 19:08:38
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| Le cellule dopo la piastratura appaiono ben separate. Come substrato uso la polilisina PM> 300.000. |
Liven
"Pillola azzurra, fine della storia: domani ti sveglierai in camera tua e crederai a quello che vorrai. Pillola rossa: resti nel paese delle meraviglie e vedrai quant’ é profonda la tana del bianconiglio…" |
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elly_
Utente Junior
400 Messaggi |
Inserito il - 05 novembre 2008 : 20:53:16
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prova a aggiungere DNasi alle tue soluzioni tranne nel medium. co“ ovresti risolvere il problema.  |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
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elly_
Utente Junior
400 Messaggi |
Inserito il - 06 novembre 2008 : 09:33:19
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Citazione:
Messaggio inserito da chick80
Urca, e resistono alla tripsinizzazione? wow... ma sono embrionici o adulti?
ho usato anch'io la tripsina per le primarie neuronali... resistono bene. per le primarie conviene usare pups al massimo P6-P8, dopo si ottengono risultati peggiori. se uno riesce a fare primarie da topi adulti mi spieghi come faccia che io ho provato ma senza risultati incoraggianti! |
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liven
Nuovo Arrivato
Città: Roma
15 Messaggi |
Inserito il - 06 novembre 2008 : 15:38:09
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Per rispondere a chick80: Sono neuroni prelevati da corteccia e ippocampo di emnrioni di 14-18gg. Resistono bene alla tripsinizzazione e mi durano 2 settimane( almeno ad una valutazione morfologica: hoechst, MAP2 , N Caderin , phalloidin, GFAP, ecc), non ho fatto saggi MTT, LDH o TUNEL, quindi non posso essere più preciso di così.
Per rispondere a elly: Grazie per la dritta, proverò con la DNasi, dato che mi ricorda tanto la pappetta del DNA!!
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Liven
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 06 novembre 2008 : 16:41:06
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Citazione:
Sono neuroni prelevati da corteccia e ippocampo di emnrioni di 14-18gg.
Ah ok... allora ci credo!
Citazione:
se uno riesce a fare primarie da topi adulti mi spieghi come faccia che io ho provato ma senza risultati incoraggianti!
Avevo messo un protocollo nella sezione protocolli:
http://www.molecularlab.it/protocolli/protocol.asp?id=18
In realtà per la dissociazione ho visto che la papaina è molto meglio della tripsina. |
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elly_
Utente Junior
400 Messaggi |
Inserito il - 06 novembre 2008 : 18:30:02
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Citazione:
In realtà per la dissociazione ho visto che la papaina è molto meglio della tripsina.
in realtà adesso uso la papaina anch'io ma prima ho usato la tripsina. diciamo che la tripsina va bene per neuroni abbastanza resistenti (chiamiamoli così), per quelli più delicati sono passata alla papaina. ema oltre P8 non danno delle primarie soddisfacenti.
che tipo di neuroni dissoci? |
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liven
Nuovo Arrivato
Città: Roma
15 Messaggi |
Inserito il - 06 novembre 2008 : 18:45:48
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per ora solo neuroni di ippocampo e corteccia di ratto (Wistar).
Ma dalla prossima settimana inizio a mettere mano sui topi(balb/c e scid).
staremo a vedere che succede (nelle mie mani ovviamente!
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Liven
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 06 novembre 2008 : 21:16:50
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Io le colture le ho fatte di neuroni ipotalamici da topi adulti (40-60 giorni).
Per il tipo di esperimenti che dovevo fare mi interessava usarle dopo max 3-4 giorni, quindi non so dirti per quanto tempo possano resistere. Ho visto che aggiungere CNQX e AP-5 al medium aiuta (sono bloccanti dei recettori del glutammato, quindi evitano almeno in parte l'eccitotossicità) |
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elly_
Utente Junior
400 Messaggi |
Inserito il - 06 novembre 2008 : 21:56:35
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| s“ aggiungo anch'io quei bloccanti nel medium. io per˜ lavoro coi neuroni dopaminergici. ci sarˆ qualche differenza rispetto ai tuoi! |
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Colture Primarie Di Neuroni
Didattica
