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Flap
Utente Junior
172 Messaggi |
 Inserito il - 14 novembre 2008 : 19:25:44
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Qulacuno ha esperienza in clonaggio di un prodotto di PCR blunt con un vettore blunt end? Io ho effettuato una reazione di ligation tra il prodotto di PCR e questo vettore ( dell'invitrogen ), ho trasformato e piastrato in un terreno con kanamicina ( perchè il vettore ha questa resistenza ). In teoria l'unica colonia che è cresciuta su questa piastra doveva contenere il vettore con l'inserto ( dato che pare che questo vettore non possa richiudersi). Invece l'inserto non c'è . Qualcuno ha un'idea di cosa possa essere successo?
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1912 Messaggi |
Inserito il - 15 novembre 2008 : 11:21:24
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IL fatto che questi vettori si chiudano e' un mistero anche a me e' successo la stessa cosa
http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=9149&SearchTerms=pGEM
Il clonaggio blunt di per se e' un po' piu' problematico,e la difficolta' aumenta all aumentare della grandezza del frammento,
tra l altro inizio a pensare che i sistemi di riparo all interno di E.Coli DH5-alfa (ammesso che sia questa la tua linea,),fosforilano e ligano il vettore 
ovviamente tutto questo nel caso in cui tu esegui "alla lettera" i protocolli di ligazione e trasformazione
qual'e' il tuo vettore? e quanto e' grande l inserto? |
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Flap
Utente Junior
172 Messaggi |
Inserito il - 17 novembre 2008 : 19:49:44
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| L'inserto è grande 1500pb e il vettore ( transitorio )è PCR blunt dell'invitrogen. La linea cellulare su cui trasformo è XL1Blue di E.Coli. Adesso ci stiamo riprovando..vediamo che succede.. |
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1912 Messaggi |
Inserito il - 18 novembre 2008 : 00:02:01
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mha...io questo vettore non l ho mai sentito,non c'e' una mappa in pdf che mi potresti passare ?
per curiosita'
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Flap
Utente Junior
172 Messaggi |
Inserito il - 18 novembre 2008 : 14:26:49
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| No...pero se vai sul sito dell'invitrogen ci dovrebbe essere. Il suo nome è PCR blunt vector..è 3500 pb. Ma è solo transitorio, ci serve per digerire bene l'inserto e poi clonarlo all' interno di un vettore per Saccaromiches ( PYESnt2c ). Perchè la digestione dell'inserto da solo per dargli le sticky end non ha dato buoni risutati. E allora vogliamo digerirlo all'interno di questo vettore blunt dal momento che anche l'inserto è blunt e poi digerire con gli stessi enzimi che utilizzeremo per digerire il vettore PYES. Non so se mi sono spiegata bene...sono ancora alle prime armi. |
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1912 Messaggi |
Inserito il - 18 novembre 2008 : 15:57:18
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Certo mi rendo conto che questo clonaggio non e' molto semplice,sia perche' e' blunt e sia perche' il frammento e' bello grande;
pero' mi chiedo ...che taq usi? perche' se usi una taq che ha un attivita' transferasica la difficolta' si amplifica ..quindi in questo caso dovreste "pulire" il prodotto di PCR da quelle A terminali
sono alle prime armi anch io
in teoria dovrebbe esserti piu' "facile" con un TA vector.....ma visto quello che e' successo a me
ho trovato la mappa del vettore ma non il protocollo di clonaggio,peccato volevo vedere se era simile al TA ma credo di si
...fammi sapere |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 18 novembre 2008 : 16:16:24
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Citazione:
Messaggio inserito da Patrizio
ho trovato la mappa del vettore ma non il protocollo di clonaggio,peccato volevo vedere se era simile al TA ma credo di si...
Qua trovi tutto:
Zero Blunt® PCR Cloning Kit
Mappe e protocollo!
Il realtà non è come il TA cloning.
E non è vero che il vettore non si possa richiudere, si può richiudere ma il fatto è che contiene un gene letale ccdB che non permette la crescita di E. Coli. Se viene inserito il frammento questo gene viene interrotto e quindi Coli può crescere e in "teoria" le colonie che osservi sulla piastra (ovviamente fai anche la selezione con l'antibiotico) contengono il vettore con inserito il frammento. Il frammento però essendo blunt si può inserire sia in un verso che nell'altro, quindi devi controllare che sia inserito nel verso giusto.
In realtà se il vettore si richiude su se stesso senza il frammento non dovresti avere colonie, ma probabilmente in qualche modo (non descritto nel protocollo) si inattiva comunque il gene ccdB, infatti se guardi nei Troubleshooting riporta anche il caso di trasformanti che non contengono l'inserto.
Una colonia sola comunque mi sembra un po' pochino, prova a riguardare il protocollo e i Troubleshooting e a modificare qualcosa.
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Flap
Utente Junior
172 Messaggi |
Inserito il - 19 novembre 2008 : 18:17:57
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| Grazie raga...perchè mi avete dato molti spunti oltre che la mappa che non riuscivo a trovare. Primo..utilizzo una pfu polimerasi e quella da le blunt end. Per questo questo vettore senbrava perfetto per digerire bene l'inserto. Mi sa anche a me che abbiamo sbagliato qualcosa nella ligation perchè solo una colonia è troppo poco. Adesso che ci abbiamo riprovato le colonie sono tante ma sara difficile trovare quella positiva perchè abbiamo trasformato le XL1 Blue ( l'altra volta le Top10 che vanno bene ) che non sono adatte per la selezione. Infatti contengono l'episoma F che codifica per LacIq ovvero il repressore per il gene 'suicida'. Pero questo l'ho appena capito guardando il troubleshooting...domani lo dico alla prof. a cui mi sa che questo particolare è sfuggito. Mi sa che dovrò veramente leggere molto attentamente il troubleshooting...vi faccio sapere e grazie ancora per i vostri consigli. |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 19 novembre 2008 : 22:15:00
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Va beh a parte che tutto questo c'è scritto nel protocollo che andrebbe letto, prima!
Ma giusto per fare chiarezza in due parole:
XL1 Blue contengono il plasmide F che ha il gene ccdA, che è il repressore del gene ccdB.
LacIq invece è un altra cosa.
L'espressione del gene ccdB che è sotto il promotore lac sarebbe costitutiva, ma in presenza di LacIq la devi indurre aggiungendo IPTG.
XL1 Blue hanno entrambi, quindi non vanno bene!
In ogni caso qua trovi tutti i genotipi di E. Coli:
http://openwetware.org/wiki/E._coli_genotypes
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1912 Messaggi |
Inserito il - 19 novembre 2008 : 23:25:14
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Ti manderei le mie...s ammazzano da sole..figurati senza resistenza
...ebbrava alla nostra pinuccia |
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d.goldy
Nuovo Arrivato
39 Messaggi |
Inserito il - 20 novembre 2008 : 15:58:34
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Ciao,
io se ti interessa ho un suggerimento per lo screening delle colonie trasformate.
Anch'io ho avuto dei problemi durante un clonaggio e poiché avevamo una marea di colonie, alcune trasformate ed altre no abbiamo disegnato 2 primers uno che cade nell'inserto e uno fuori l'inserto e abbiamo fatto una pcr con questi primers per ogni colonia. invece che aggiungere il dna aggiungi la colonia:)
pero ti sia utile.
Ciao |
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Flap
Utente Junior
172 Messaggi |
Inserito il - 21 novembre 2008 : 20:59:29
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Fammi capire meglio...noi normalmente per vedere se ci sono trasformanti estraiamo il pasmide e lo digeriamo per vedere se appare la banda dell'inserto ( un giorno si vedrà...:). Tu invece fai una PCR sul dna plasmidico estratto dalla colonia? E perchè dici che invece di aggiungere il dna aggiungi la colonia? Devi prima e comunque fare la miniprep..no? Perchè se è cosi mi sa che il metodo che usiamo noi è più veloce perchè una digestione di controllo dura meno di una pcr. Ma magari non ho capito...
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1912 Messaggi |
Inserito il - 21 novembre 2008 : 22:46:16
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Citazione:
Messaggio inserito da d.goldy
invece che aggiungere il dna aggiungi la colonia:)
pero ti sia utile.
Ciao
E' una colony PCR ed e' la prima cosa che si fa dopo una trasformazione ,ma comunque se vai a ligare un prodotto di PCR o con il primers o con gli enzimi(meglio se piu' di uno) se c'e' la vedi lo stesso,Il vantaggio e' che in effetti non devi sprecare la mini e se non hai primers interni puoi usare quelli dati dal vettore gli M13 FF e RW
Citazione:
Messaggio inserito da Flap
che invece di aggiungere il dna aggiungi la colonia? Devi prima e comunque fare la miniprep..no?
No perche' vai a scoppiare i batteri e amplifichi il plamide libero,se non hai il protocollo te lo scrivo
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Flap
Utente Junior
172 Messaggi |
Inserito il - 22 novembre 2008 : 09:43:37
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| Ho dato un' okkiata ad un protocollo di colony pcr...Ma che cos'è che lisa le cellule ? é solo lo spipettare o c'è qualcos'altro? |
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1912 Messaggi |
Inserito il - 22 novembre 2008 : 10:47:41
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vai nella sezione dei protocolli della PCR ho messo il procedimento e i dettagli,se ci sono problemi chiedi
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Flap
Utente Junior
172 Messaggi |
Inserito il - 22 novembre 2008 : 15:01:24
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| Forte...il protocollo che avevo trovato io era diverso ma questo mi sembra geniale. Oltretutto cosi risparmierei anche il giorno di incubazione per gli inoculi e tante Falcon...( sono un bene in via di estinzione da noi:). Ma posso utilizzare anche i primers che ho utilizzato per amplificare l'inserto? Perchè mi sa che abbiamo solo quelli di primers...anche se così non discrmino tra la colonia che può aver acquisito solo l'inserto e quella che ha il vettore con l'inserto...Forse i primers solo per l'inserto non vanno bene..Aspetto conferma.. |
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Flap
Utente Junior
172 Messaggi |
Inserito il - 22 novembre 2008 : 15:20:46
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| Inserto da solo nella cellula. La cellula non crescerebbe in presenza di kanamicina. Inserto ricircolarizzato e vettore ricicoriclarizzato da soli la cellula morirebbe. In teoria potrebbero andare bene ma in pratica è risaputo che a volte il gene ccdA può inattivarsi. comunque poi devo analizzarle con gli enzimi comnque per essere sicura. Se trovo la colonia X che ha l'inserto, se riesco a non prenderla tutta posso analizzarla dopo con miniprep e digestione. Se le colonie non sono troppo piccole..sennò prelevarne la metà di una è complicato..almeno per me. |
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1912 Messaggi |
Inserito il - 22 novembre 2008 : 17:48:08
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Ma non l hai letto il mio protocollo ?perche' dici devi stare attenta a non prenderla tutta ?quelli nel frattempo che tu fai la colony ti stanno crescendo nei 300ul di LB + ant
si, in genere i protocolli delle colony ti dicono di prendere una parte della colonia,ma e' un casino quindi meglio inocularla prima cosi' alla fine se sono positive ti verra' piu' facile fare le crescite
per quanto riguarda i primers,si, puoi anche usare quelli
non ti fare troppi pensieri vai cosi' e vai tranquilla se esce la banda attesa saranno positive |
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Flap
Utente Junior
172 Messaggi |
Inserito il - 22 novembre 2008 : 23:16:39
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| Non ci avevo pensato che gli inoculi poi comunque li posso utilizzare per la miniprep..è proprio perfetto. Provo a proporlo alla mia correlatrice ( sono una tesista ) e vediamo che dice. A me sembra piu rapido fare cosi rispetto a quello che facciamo noi. Grazie comunque...ti farò sapere che succede.. |
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1912 Messaggi |
Inserito il - 22 novembre 2008 : 23:22:10
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| good luck |
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Flap
Utente Junior
172 Messaggi |
Inserito il - 26 novembre 2008 : 21:55:51
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| Alla fine niente...dobbiamo ricominciare tutto daccapo perchè i primers che avevamo non vanno bene. Pare che abbiano fatto confusione tra siti di stop e siti di restrizione ( non ho ben capito ).Quindi il lavoro è bloccato nell'attesa dei primers giusti.. |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 26 novembre 2008 : 22:01:50
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| Ma in che razza di posto stai facendo la tesi??? |
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Flap
Utente Junior
172 Messaggi |
Inserito il - 28 novembre 2008 : 11:19:57
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| Non mi va di farti il nome perkè metterei in cattiva luce la gente che lavora lì dentro. E non credo che se lo meritino..Però sappi che non è un posto così malaccio.. |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 28 novembre 2008 : 20:18:41
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No no per carità, non volevo che tu mi facessi il nome! Immagino ci siano anche persone che lavorano bene.
Però da quello che racconti sembra un po' strano!
Insomma "confusione tra siti di stop e siti di restrizione" (immaginando che per siti di stop si intenda codoni di stop, altrimenti non mi è molto chiaro!), mi sembrava veramente strano!
Poi io sono dell'idea che una persona in tesi vada seguita, invece mi dava l'impressione che chi ti segue non sappia molto come fare. Ma magari è solo una mia impressione!
Comunque in bocca al lupo! |
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Flap
Utente Junior
172 Messaggi |
Inserito il - 29 novembre 2008 : 12:21:07
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| riguardo a siti di stop e siti di restrizione mi sono spiagata male..cioè quello che è successo è che la prteina aveva un codone di stop in aniticipo e dunque anche se fossimo riusciti a clonare il frammento la proteina espressa non sarebbe stata funzionale. Comunque grazie per i tuoi consigli..ti faro sapere gli sviluppi. |
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1912 Messaggi |
Inserito il - 01 dicembre 2008 : 00:39:11
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Cotrasfetta un t-RNA suppressor oppure tratta le cellule con gentamicina...impalli il ribosoma e si va lisci
ovviamente..non so l andazzo dei tuoi esperimenti ma e' solo uno spunto per superare eventualmente questo problema
PS:sinceramente sarei stato curioso di vedere la fine di questo trascritto |
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PCR blunt vector
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