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 Biologia Molecolare
 Sequenziare una 5'UTR
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kaligari
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6 Messaggi

Inserito il - 21 marzo 2006 : 20:34:51  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di kaligari Invia a kaligari un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Dovrei trovare un modo per la determinazione della sequenza all'estremità 5' di un generico mRNA.

Qualcuno ha qualche idea?

fpotpot
Utente

Città: middleofnowhere


1056 Messaggi

Inserito il - 22 marzo 2006 : 10:38:50  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di fpotpot Invia a fpotpot un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
adesso dirò una cavolata:se tu partissi da un reverse primer vicino all'estremità 5 primo?cioè se retrotrascivi in un cDNA l'mRNA a partire dall'estremità della sequenza nota vicino all'UTR 5 primo,ottieni un mini cDNA che ha la sequenza iniziale+l'UTR..e poi amplifichi cDNA ottenuto in PCR e cloni in vettore e mandi a sequenziare...
HO DETTO UNA CAVOLATA super-scienziati?..(vi prego ditemi di no...)
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kaligari
Nuovo Arrivato



6 Messaggi

Inserito il - 22 marzo 2006 : 17:26:20  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di kaligari Invia a kaligari un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Grazie per la risposta.Si non mi sembra male.
Il fatto è che io non conosco nulla di questo mRNA,mentre per sequenziare la 3'UTR io avrei usato un primer di oligo dT e la transcittasi inversa e poi come hai detto tu.per la 5'UTR che primer uso se non conosco nulla della sequenza di mRNA?esistono primer universali?
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fpotpot
Utente

Città: middleofnowhere


1056 Messaggi

Inserito il - 22 marzo 2006 : 19:17:45  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di fpotpot Invia a fpotpot un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
...avevo capito che conoscevi la seq di mRNA,non so se sia possibile avere primer universali per la seq di mRNA,a parte le utr,non sai se è omologo a qualche altro mRNA per quella proteina di altre specie o per proteine simili?magari da lì potresti provare a fare un primer in una parte conservata in varie specie della sequenza vicino a 5primo utr...
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Ra1D
Utente Junior

giro-Ra1D

Prov.: Bergamo
Città: Treviglio


174 Messaggi

Inserito il - 22 marzo 2006 : 19:24:21  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Ra1D Invia a Ra1D un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Per il 3' conviene usare un oligodT e sfruttare la coda di polyA ...ma sorge un dubbio, come amplifichi con PCR se non hai un primer specifico interno?
Se non conosci la sequenza puoi fare una RT-PRC con random priming.
Di solito si usano primers corti, circa 6 nucleotidi, che hanno tutti i possibili nucleotidi ad ogni posizione.
Una volta sequenziata almeno una parte del tuo cDNA (mRNA), per ottenere precisamente il 5' e il 3' puoi fare una RACE-PCR
http://www.molecularlab.it/laboratorio/tecniche/race.asp

...e vicinissimo al mio sapere si accampa la tenebra della mia ignoranza...
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v_cetica
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3 Messaggi

Inserito il - 23 marzo 2006 : 14:16:45  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di v_cetica Invia a v_cetica un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Io per amplificare regioni fiancheggianti a regioni note ho usato la tecnica Genome walking:
http://www.evrogen.com/t9.shtml
esistono dei kit, è molto carina!
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kaligari
Nuovo Arrivato



6 Messaggi

Inserito il - 23 marzo 2006 : 16:24:41  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di kaligari Invia a kaligari un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Grazie davvero ragazzi,proverò!
Buona giornata!
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