Feed RSS: Molecularlab.it NewsiCalendar file

RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends)

 

Tecnica usata anche come per la fase RT (retro trascrizione) della RT-PCR. Ha come scopo quello di amplificare i messaggeri e produrre cDNA

.  Dall'estremitā 3'.
Cominciamo a volere copiare il 3' poliadenilato, usiamo un oligo TTTTTTTTTT,  si attacca a tutti i messaggeri che hanno la coda, quindi tutte le molecole poliadenilate vengono copiate (passaggio aspecifico), togliamo l'RNA e come rendiamo specifica la 2° reazione? devo conoscere una sequenza interna del messaggero (almeno 20bp), se di questo non so proprio nulla la tecnica non č applicabile. Disegno un oligo specifico, si appaia dandomi una copia ds, con questa, do sia l'oligo specifico che il poliT, e procedo con l'amplificazione.
Il primo processo č poco processivo: al max si ottiene una kilobase. Non necessariamente devo mettere a metā l'oligo, dipende da dove conosco la sequenza (il vero fattore limitante)

.  Dall'estremitā 5'.
Parto dall'inizio con l'oligo specifico, dato ai messaggeri, trascrittasi inversa copierā solo la coda 5'term del messaggero che interessa a noi. Il passaggio successivo č: se non non sappiamo come termina il 5' che oligo ci mettiamo? ci viene incontro la terminal transferasi: sulla prima copia che abbiamo ottenuto a ss attacchiamo una coda di poliA, e il gioco č fatto. Faremo i secondo strand attaccandogli un poliT, che ha solo la funzione di ottenere il secondo strand, non di partire (a differenza di prima). Ottenuto il ds proseguiamo con la classica PCR.

 

 
Disclaimer & Privacy Policy