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andreactf
Nuovo Arrivato



5 Messaggi

Inserito il - 14 maggio 2009 : 18:28:49  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di andreactf Invia a andreactf un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ciao a tutti;
mettiamo che io abbia deciso di trascrivere e tadurre una proteina in vitro.Per ottenere il cDNA templato da utilizzare nella trascrizione/traduzione io amplifico la sequenza della mia proteina su pcr e poi clono questa sequenza nel vettore pcDNA3 ma non casualmente, in modo che la sequenza codificante sia a valle del promotore T7 ed utilizzando come sequenze per gli enzimi di restrizione EcoR1 e Xho1:

la sequenza è questa: promT7 EchoR1 Xho1 promSP6
ORA HO ALCUNE DOMANDE DA PORVI(QUESTO è UN PROBLEMA!!)
1)io devo quindi pensare che la mia polimerasi di fago si legherà successivamente al promotore T7???
2)se la mia sequenza codificante(che è sempre la 3'---5'??? deve stare a valle di t7 io nn posso tagliare quel filamento devo tagliare con un enzima di restrizionel'altro cioè 5'---3' e cioè la sequenza responsiva all'enzima di restrizione la devo mettere sul primer forward giusto?

GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8398 Messaggi

Inserito il - 14 maggio 2009 : 20:46:57  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Non ho capito perchè se continui ad avere problemi a capire come vanno disegnati primers non continui nella discussione precedente: http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=13078

Comunque per rispondere alle nuove domande:
Citazione:
1)io devo quindi pensare che la mia polimerasi di fago si legherà successivamente al promotore T7???

se fai una trascrizione in vitro e ci metti anche la RNA polimerasi T7 si.

Citazione:
2)se la mia sequenza codificante(che è sempre la 3'---5'??? deve stare a valle di t7 io nn posso tagliare quel filamento devo tagliare con un enzima di restrizionel'altro cioè 5'---3' e cioè la sequenza responsiva all'enzima di restrizione la devo mettere sul primer forward giusto?

NO! Sia il tuo cDNA amplificato tramite PCR che il vettore sono a doppio filamento! Non tagli un solo filamento ma entrambi, altrimenti non puoi clonate un bel niente!
Nell'altro post ti avevo anche inserito l'immagine che mi sembrava chiara.
Comunque posto che gli enzimi di restrizione tagliano entrambi i filamenti le sequenze riconosciute da EcoRI e XhoI sono rispettivamente queste:
EcoRI
G^A A T T C
C T T A A^G

XhoI
C^T C G A G
G A G C T^C


(con ^ è indicato dove l'enzima taglia, producono estremità coesive infatti su un filamento il taglio avviene in un punto e sull'altro un un altro punto!)

Quindi devi produrre un prodotto di PCR che contenga il tuo cDNA fiancheggiato da queste sequenze così:

G^A A T T C  NNN ATG NNNNNNNNNNNNN TGA NNN C^T C G A G
C T T A A^G  NNN TAC NNNNNNNNNNNNN ACT NNN G A G C T^C


che tagliato dai due enzimi di restrizione diventerà:

  A A T T C  NNN ATG NNNNNNNNNNNNN TGA NNN C
          G  NNN TAC NNNNNNNNNNNNN ACT NNN G A G C T  


Il vettore tagliato con gli stessi enzimi di restrizione avrà le estremità complementeri e quindi si potrà appaiare:



          A A T T C  NNN ATG NNNNNNNNNNNNN TGA NNN C
                  G  NNN TAC NNNNNNNNNNNNN ACT NNN G A G C T  


NNNNNNN G                                             T C G A G NNNNNNNNNN
NNNNNNN C T T A A                                             C NNNNNNNNNN


In questo modo:
NNNNNNN G A A T T C  NNN ATG NNNNNNNNNNNNN TGA NNN C T C G A G NNNNNNNNNN
NNNNNNN C T T A A G  NNN TAC NNNNNNNNNNNNN ACT NNN G A G C T C NNNNNNNNNN


I primers quindi li devi disegnare così:
(vedi sequenze sottolineate)

G^A A T T C  NNN ATG NNNNNNNNNNNNN TGA NNN C^T C G A G
C T T A A^G  NNN TAC NNNNNNNNNNNNN ACT NNN G A G C T^C


Chiaro adesso?
Se avessi altri dubbi ti prego di continuare in questa discussione.

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