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tini87
Nuovo Arrivato

Prov.: RM
Città: Rocca Priora


8 Messaggi

Inserito il - 06 giugno 2009 : 15:12:48  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di tini87 Invia a tini87 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao A TUTTI!!!!!
mi sono appena inscritta a questo sito, anche se non è la prima volto che ci entro, anzi mi e stato molto di aiuto in momenti KO!!!!
Vi chiedo un aiuto, devo assulutamente passare l'ultimo esame prima di laurearmi a luglio, quindi ho un pò di domande per me poco chiare (le ho prese da esami vecchi del prof di ing. genetica):
1)Come faccio ad esprimere un allele e come ne controllo l'espressione in un topo transgenico????? (ho pensato fattori di trascrizione + RT PCR)

2)TOPI TRANSGENICI per il KO di geni si possono ottenere in omozigosi????

3)un KO per un gene ha il fenotipo della blastocisti o delle cellule ES donatrici???

...eh vi giuro l'ultima!!!
4)come scelgo la sequenza di una sostituzione da fare all'interno di un aplicone tramite mutagenesi con PCR????

grazieeeeeeeeeeee

chick80
Moderatore

DNA

Città: Edinburgh


11491 Messaggi

Inserito il - 06 giugno 2009 : 15:54:17  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
1)Come faccio ad esprimere un allele e come ne controllo l'espressione in un topo transgenico????? (ho pensato fattori di trascrizione + RT PCR)


Non capisco cosa vuoi sapere nella prima parte della domanda, comunque per controllarne l'espressione puoi fare PCR, Western blot, immunoistochimica, o anche altre tecniche, dipende dalla situazione specifica.

Citazione:
2)TOPI TRANSGENICI per il KO di geni si possono ottenere in omozigosi????

Sì, se il gene non è essenziale alla vita. E anche in quei casi ci sono dei trucchi per ottenere omozigoti (es. promotori inducibili)

Citazione:
3)un KO per un gene ha il fenotipo della blastocisti o delle cellule ES donatrici???

Sarà chimerico.

Citazione:
4)come scelgo la sequenza di una sostituzione da fare all'interno di un aplicone tramite mutagenesi con PCR????

Dipende ovviamente da che cosa vuoi ottenere...

Vedi anche
http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=422

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tini87
Nuovo Arrivato

Prov.: RM
Città: Rocca Priora


8 Messaggi

Inserito il - 07 giugno 2009 : 09:35:09  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di tini87 Invia a tini87 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
GRAZIE PER AVERE PROVATO AD INTERPRETARE LE DOMANDE DEL MIO PROF...

cmq nel caso della domanda n 3, la rispesta è chimerico perchè avrà un fenotipo metà per le cellule ES che protrebbero essere state mutagenizzate e metà della blastocisti???
grazie ancora
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tini87
Nuovo Arrivato

Prov.: RM
Città: Rocca Priora


8 Messaggi

Inserito il - 07 giugno 2009 : 09:40:17  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di tini87 Invia a tini87 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
....dimenticavo
LA DOMANDA 4
Citazione:
--------------------------------------------------------------------------------
4)come scelgo la sequenza di una sostituzione da fare all'interno di un aplicone tramite mutagenesi con PCR????
--------------------------------------------------------------------------------


pensavo che dovendo costruire primer interni con coda che dopo alcuni cili di pcr mi andranno ad escludere la sequenza da sostiture e quindi inglobando le code dei primer, devo per forza conoscere la sequenza per poter costruire questi primer...
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chick80
Moderatore

DNA

Città: Edinburgh


11491 Messaggi

Inserito il - 07 giugno 2009 : 10:02:19  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
cmq nel caso della domanda n 3, la rispesta è chimerico perchè avrà un fenotipo metà per le cellule ES che protrebbero essere state mutagenizzate e metà della blastocisti???


Esatto (non sarà esattamente 50% e 50% immagino, ma l'idea è quella).
Vedi anche la figura che avevo postato qui: http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=13381

Citazione:
pensavo che dovendo costruire primer interni con coda che dopo alcuni cili di pcr mi andranno ad escludere la sequenza da sostiture e quindi inglobando le code dei primer, devo per forza conoscere la sequenza per poter costruire questi primer...

In generale sì, devi conoscere la sequenza, o almeno parte di essa. Io intendevo che la sequenza specifica per una sostituzione dipenderà molto da quello che ti interessa ottenere.

Forse la spiegazione scritta in questa discussione potrebbe interessarti: http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=1168

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tini87
Nuovo Arrivato

Prov.: RM
Città: Rocca Priora


8 Messaggi

Inserito il - 07 giugno 2009 : 10:50:35  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di tini87 Invia a tini87 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
grazieeeeeeee
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8398 Messaggi

Inserito il - 07 giugno 2009 : 12:03:36  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
In realtà mi lasciano molto in dubbio queste domande...
non si capisce molto bene cosa voglia sapere!

Riguardo al topo KO:
tu inietti le cellule ES nella bastocisti e ottieni un topo che sarà una chimera, ma poi reincroci il topo ottenuto per avere il KO, solo quelli che hanno il costrutto KO integrato nelle cellule della linea germinale ti daranno il "vero" KO, che è quello che utilizzi alla fine.
E questo avrà il fenotipo delle cellule ES, prima eterozigote e poi se lo reincroci puoi ottenere il topo KO omozigote che ha veramente il fenotipo delle cellule ES.
Vedi oltre ai link indicati da chick80: http://en.wikipedia.org/wiki/Knockout_mouse

Per la 1
Citazione:
1)Come faccio ad esprimere un allele e come ne controllo l'espressione in un topo transgenico????? (ho pensato fattori di trascrizione + RT PCR)

credo che la prima parte intenda che devi mettere un promotore nel tuo costrutto che si andrà ad integrare del DNA del topo per far si che il gene venga espresso.
Poi per valutare l'espressione ti ha risposto chick80, in generale vai a vedere la presenza di RNA e di proteina del transgene. Se hai un marcatore (tipo GFP ad es.) puoi andare a vedere anche la presenza di quello. Poi le tecniche sono varie e come diceva chick80, dipende dalla situazione.

Per l'ultima sulla mutagenesi...
Citazione:
4)come scelgo la sequenza di una sostituzione da fare all'interno di un aplicone tramite mutagenesi con PCR????

dipende da che sostituzione vuoi fare, a cosa ti serve... non mi sembra abbia moto senso questa domanda!
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tini87
Nuovo Arrivato

Prov.: RM
Città: Rocca Priora


8 Messaggi

Inserito il - 07 giugno 2009 : 12:42:50  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di tini87 Invia a tini87 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Si infatti la domanda della mutagenesi ha aperto una discussione anche nel laboratorio dove faccio il tirocinio...ma purtroppo il mio prof pone domande un pò incoprensibili e oltre a quello anche gli appunti sono indecifrabili!!!!
cmq grazie
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