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lizard16
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Inserito il - 20 giugno 2009 : 19:58:24  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di lizard16 Invia a lizard16 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Salve a tutti, avrei un quesito da sottoporVi riguardante i macroarray, microarray e genechip.
Come scrissi in un precedente post sto studiando da me un pò di genetica e mi sono imbattuto in questo argomento per cui ne vorrei capire di più.
Allora...cercherò di essere breve e conciso in modo tale da avere una risposta precisa (vi ringrazio anticipatamente per le risposte...!).
Gli array sono una moderna tecnica di indagine biomolecolare in grande sviluppo e sono delle matrici ordinate in cui in ogni cella è presente un segmento di DNA detto "probe" immobilizzato su di un supporto( vetrino o nylon) in modo opportuno( legami covalenti o non covalenti alla superficie porosa(nylon) o non porosa(vetro).
Vengono utilizzati per l'Analisi di Espressione, la Genotipizzazione etc. e fondano la loro utilità e il loro principio sulla possibilità di due filamenti di Dna a singola elica di rinaturarsi, riconoscendo reciprocamente le regioni complementari, formando molecole ibride.
Senza entrare nel dettaglio vorrei capire bene come funzionano, ovvero, nel caso si debbano utilizzare in un esperimento su cellule cancerose per poter eseguire ad esempio un'analisi di espressione quali sono i passi virtuali da compiere?
Chiedo questo perchè non essendo mai stato in un laboratorio vorrei riuscire a capire quale sia il modo di operare per poter ad esempio condurre uno studio sulla differnza di espressione tra due gruppi di cellule.
Per esempio:
Supponiamo che io abbia due campioni, uno di cellule sane e l'altro di cellule affette da cancro(o qualsivoglia malattia).
Allora ad esempio estraggo gli mRNA da entrambi i gruppi e li converto in cDNA( ovvero il filamento complementare al DNA di partenza delle cellule)attraverso la transcrittasi inversa.
A questo punto marco poniamo il gruppo delle cellule cancerose con una sonda fluorescente rossa, l'altro gruppo(quello sano) con una sonda fluorescente verde.
Per cui il passo seguente, sempre semplificando il ragionamento ( spero mi perdoniate per la semplicità di esposizione) è quello di mescolare e ibridare i campioni sperimentali di cellule sane e malate sul microarray( il microarray che solitamente è preparato da ditte specializzate che cosa contiene?una probe con profilo di espressione normale suppongo...) che viene poi lavato per rimuovere il cDNA che non si è legato (ibridato); il cDNA dovrebbe quindi legarsi al probe sul microarray...
A questo punto che posso dire circa il mio esperimento?...cioè osservo attraverso scansione l'intensità della fluorescenza...e...le sonde fluorescenti legate alle probe o tra di loro che possono portarmi ad affermare...?

Grazie a tutti per qualsiasi risposta possiate darmi e ancora complimenti per il sito!
Sono bene accette indicazioni su siti in cui reperire informazioni su Microarray, Macroarray e Genechip...
Grazie ancora...

GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8398 Messaggi

Inserito il - 20 giugno 2009 : 20:49:31  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Beh innanzitutto complimenti, nonostante tu stia studiando da solo, mi sembra che le cose tu le abbia capite abbastanza bene!
Qualche considerazione:
Citazione:
Gli array sono una moderna tecnica di indagine biomolecolare in grande sviluppo e sono delle matrici ordinate in cui in ogni cella è presente un segmento di DNA detto "probe" immobilizzato su di un supporto( vetrino o nylon) in modo opportuno( legami covalenti o non covalenti alla superficie porosa(nylon) o non porosa(vetro).

si non sono sempre DNA, ma direi che come concetto va benissimo.
"probe" è semplicemente il termine Inglese (anche se a volte utilizzato anche in Italiano), in Italiano sarebbe "sonda".

Per capire bene come funziona ti consiglio di guardarti questa animazione: http://www.bio.davidson.edu/Courses/genomics/chip/chip.html
è fatta in modo veramente semplice e chiaro.
In questa animazione considerano Lieviti cresciuti in presenza o in assenza di ossigeno, ma ovviamente con cellule normali e tumorali è la stessa cosa.
L'avevo già postato in questa discussione: http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=1542
magari anche la discussione ti può essere utile!
Scusa se ti rimando a dei link al posto di rispondere direttamente alle domande, ma credo che come sia spiegato nell'animazione risulti più semplice.
Poi magari se ti rimangono altri dubbi chiedi pure.

Intanto ti rispondo solo in generale a questa domande:
Citazione:
il microarray che solitamente è preparato da ditte specializzate che cosa contiene?una probe con profilo di espressione normale suppongo..

il microarray contiene sonde per vari geni (o meglio cDNA), non c'è nessun profilo di espressione "normale", ma valuti la fluorescenza (questo credo ti sarà più chiaro dopo aver visto l'animazione) e compari quella del normale (ad es. verde) con quella del campione in esame ad es. cellule tumorali (rosso)
Esistono vari microarray con sonde per diversi geni o gruppi di geni.

Beh buona visione, poi magari rivediamo i dubbi!

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lizard16
Nuovo Arrivato



6 Messaggi

Inserito il - 20 giugno 2009 : 21:19:42  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di lizard16 Invia a lizard16 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
GFPina...Grazie mille per la tua risposta ed il filmato...attraverso i filmati è immediato comprendere di cosa si stia parlando...soprattutto per chi come me non sa nemmeno come possa essere fatto un laboratorio...eheh...
Sei stata gentilissima come sempre...prima di augurarti un buon sabato sera però volevo chiederti una cosa: a questo punto southern e northern blotting sono molto simili o no...?!...Nel senso che nella tecnica di soutehern blotting (per Dna giusto?) e northern blotting (per Rna) in sostanza si utilizza più o meno lo stesso principio( so che sono antecedenti ai microarray, genechip o macroarray...) e quindi se mi pare di aver capito bene...alla fine queste tecniche permettono di soppiantare almeno in parte gli studi sperimentali su cavie (ovviamente penso solo in determinati casi, almeno per ora...) in quanto a livello di numerosità dei dati che è possibile ottenere (attraverso la PCR) si hanno migliaia di dati per campione su centinaia di campioni diversi...insomma proprio entusiasmante!!
Grazie ancora di tutto...buon sabato...vedrò il filmato e poi se ho dubbi su qualcosa scriverò...ok?!...
Grazie mille!
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8398 Messaggi

Inserito il - 21 giugno 2009 : 15:40:22  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
scusa ma in questo mi sembra che tu abbia un po' di confusione, provo a fare un pochino di chiarezza.

Citazione:
southern e northern blotting sono molto simili o no...?!...Nel senso che nella tecnica di soutehern blotting (per Dna giusto?) e northern blotting (per Rna) in sostanza si utilizza più o meno lo stesso principio

Si Southern è per DNA è Northern per RNA (esiste anche il Western per le proteine, che però è una cosa diversa).
Sul fatto che si utilizzi lo stesso principio... mmm... diciamo che "mooooooolto" in linea generale, cioè anche in questi casi utilizzi sonde che si andranno ad ibridare al DNA o RNA, però la tecnica è molto diversa.


Fai prima un gel dove fai migrare frammenti di DNA o RNA e questi migreranno in base al peso molecolare (grandezza), poi li trasferisci su una membrana e li fai ibridare con una sonda.
In questo caso tu hai una sola sonda che si lega e vai a vedere dove si è legata, non hai tutto il pattern che hai con i microarray.


ovviamente ho molto semplificato perchè esistono mote variazioni di queste tecniche.

Citazione:
alla fine queste tecniche permettono di soppiantare almeno in parte gli studi sperimentali su cavie (ovviamente penso solo in determinati casi, almeno per ora...)

Per questo ti devo rispondere proprio un bel "NO"!
Queste tecniche vengono utilizzate in vari campi, sia per lo studio di campioni estratti da pazienti sia per lo studio di campioni presi da cavie.
L'utilità di utilizzare delle cavie in laboratorio è dovuta ad altri fattori, che non sto qua a discutere, ma completamente indipendenti dall'utilizzo di queste o altre tecniche.

Citazione:
in quanto a livello di numerosità dei dati che è possibile ottenere (attraverso la PCR) si hanno migliaia di dati per campione su centinaia di campioni diversi...

si si hanno migliaia di dati, a volte però questo diventa un problema perchè l'analisi di tutti questi dati risulta molto complessa.
La PCR in questo caso (tecniche che abbiamo detto prima) non c0'entra però!

Spero di aver fatto un po' di chiarezza!

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prossima biologa
Utente Attivo

0625_da_la_fra



1437 Messaggi

Inserito il - 24 giugno 2009 : 11:33:31  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di prossima biologa Invia a prossima biologa un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
chiedo scusa... ho vistol'animazione e sono entrata un pò in confusione...il problema è che con la tecnica del DNA microarray ho sempre avuto problemi anche con altri esami... chi mi aiuta a risolvere queste incomprensioni una volta pr tutte?
il problema vero e proprio delle tecniche è che non sempre riesco a comprenderne i fini e quindi non riesco a ricordare o capire come farle se non so dove voglio arrivare...
la tecnica del dna microarray mi permette di tipizzare centinaia di SNP giusto?
ora io so che un DNA microarray è una griglia ordinata di molecole di DNA a sequenza nota(sonde) fissate in posizioni note di un substrato che può essere silice o vetro...

poi però sul mio quaderno al tempo della spiegazione ho scritto che la prof parla di un procedimento diretto dalla luce e dice:
sul vetro c'è una molecola covalente che ha una protezione alla luce per ogni posizione definita array. ogni posizione indica un nucleotide, l'irragiamento con la luce elimina la maschera di protezione e attiva i siti e il nucleotide programmato.
ripetendo il processo per ogni posizione sono sintetizzati sul chip i nucleotidi desiderati nelle posizioni programmate....

mi spiegate come è finito qst eperimento? è totalmente scorretto quello che ho scirtto? e se si perchè sul libro trovo spiegazione analoga? io non ne capisco il fine!
grazie a chiunque mi possa aiutare.
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marok
Utente Junior



150 Messaggi

Inserito il - 24 giugno 2009 : 12:06:48  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di marok Invia a marok un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Quello di cui parlava la tua professoressa non è un esperimento ma una delle tecniche utilizzate dalle case produttrici per creare appunto il chip.
E' il punto di partenza per i tuoi esperimenti.
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prossima biologa
Utente Attivo

0625_da_la_fra



1437 Messaggi

Inserito il - 24 giugno 2009 : 12:09:23  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di prossima biologa Invia a prossima biologa un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
e quindi io ti chiedo e chiedo a tutti coloro che possono rispondermi... se in qst modo si prepara il chip ora m spiegate come si applica la tecnica?
la mia domanda è: come si usa in DNA chip per tipizzare gli SNP?
GRAZIE 1000
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8398 Messaggi

Inserito il - 24 giugno 2009 : 12:47:04  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Premetto che la mia spiegazione e il filmato sono molto in generale, visto che la domanda era stata rivolta da una persona non del campo, non sono scesa nei particolari.
Comunque esistono vari tipi di microarray, quello descritto nell'animazione era per valutare il profilo di espressione di alcuni geni.
Quello per l'analisi dei polimorfismi è "costruito" in modo diverso, cioè nel tuo array avrai delle sonde complementari ai vari polimorfismi, ad es hai un polimorfismo C/A in questa posizione
ATGGTAGCTC/ATAGCTGAT avrai sull'array
una sonda che riconosce se c'è la A e una che riconosce la C:
TACCATCGATATCGACTA
e una che riconosce la C:
TACCATCGAGATCGACTA
in base a con quale delle due si avrà ibridazione riconosci il polimorfismo.
Ovviamente le condizioni devo essere abbastanza stringenti in modo da non avere ibridazione aspecifica.
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lizard16
Nuovo Arrivato



6 Messaggi

Inserito il - 24 giugno 2009 : 12:55:13  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di lizard16 Invia a lizard16 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
@ prossima biologa...

quello di cui parli tu (negli appunti che hai preso) se non ho capito male(non sono un esperto...) dovrebbe essere la tecnica utilizzata da "Affimetrix"(un'azienda produttrice di array) che serve per sintetizzare automaticamente e in maniera diretta gli oligonucleotidi con sequenze predeterminate in specifiche posizioni sulla superficie(vetro etc..) dell'array.
In sostanza, in maniera molto semplificata, il processo si dovrebbe svolgere in questo modo: alla superficie viene legata una prima serie di blocchi da costruzione rappresentati da deossinucleosidi con il gruppo idrossilico protetto; alcuni di questi blocchi poi vendono "deprotetti"-diciamo così- a causa dell'azione esercitata da un fascio di luce che però è selettivo, nel senso che illumina solo determintate aree del chip.
In questo modo si ha una reazione chimica che lega uno specifico nucleoside ( a sua volta protetto) nelle posizioni non protette e così via, in quanto la sequenza viene ripetuta ciclicamente producendo una serie di oligonucleotidi specifici che sono diversi tra di loro e che sono legati in posizioni note sulla superficie del chip.
Per poter operare in questo modo( protezione e deprotezione selettiva) si utilizza una maschera fotolitografica che ha il compito di coprire tutte le posizioni che non devono essere "deprotette" e, viceversa, lasciare scoperte quelle che devono essere sbloccate.
Alla fine si ottiene che il supporto è definito ad "alta densità"(densità= numero di geni/dimensione del supporto) ed in ogni area della matrice c'è un oligo diverso.
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prossima biologa
Utente Attivo

0625_da_la_fra



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Inserito il - 24 giugno 2009 : 13:06:42  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di prossima biologa Invia a prossima biologa un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da GFPina
Quello per l'analisi dei polimorfismi è "costruito" in modo diverso, cioè nel tuo array avrai delle sonde complementari ai vari polimorfismi, ad es hai un polimorfismo C/A in questa posizione
ATGGTAGCTC/ATAGCTGAT avrai sull'array
una sonda che riconosce se c'è la A e una che riconosce la C:
TACCATCGATATCGACTA
e una che riconosce la C:
TACCATCGAGATCGACTA
in base a con quale delle due si avrà ibridazione riconosci il polimorfismo.


QUINDI SE HO CAPITO così come per i trascritti ibrido gli array con cDNA MARCATI, così per gli SNP io ibrido il mio DNA di studio con 2 sonde diverse poste sugli array così che se nel SNP ho la A si lega cn la sonda che porta la T
se ho la C si lega con la sonda che porta la G.
HO CAPITO?

chiedo scusa ma devo fare un ultima domanda su questo argomento.
mi potete spiegare quest'altra cosa?: quando si ha ibridazione il profilo di fluorescenza ottenuto non solo indica quali sono gli alleli SNP(e questo lo indica nel modo che m avete appena spiegato)
ma ci permette di sapere anche se l'individuo è eterozigote o omozigote!

cosa vuol dire? che se è eterozigote lega entrambe le sonde dell'esempio che mi ha fatto GFPina mentre se è omozigote lega solo una sonda?
grazie!
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prossima biologa
Utente Attivo

0625_da_la_fra



1437 Messaggi

Inserito il - 24 giugno 2009 : 13:10:15  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di prossima biologa Invia a prossima biologa un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da lizard16
In questo modo si ha una reazione chimica che lega uno specifico nucleoside ( a sua volta protetto) nelle posizioni non protette e così via, in quanto la sequenza viene ripetuta ciclicamente producendo una serie di oligonucleotidi specifici che sono diversi tra di loro e che sono legati in posizioni note sulla superficie del chip.
Per poter operare in questo modo( protezione e deprotezione selettiva) si utilizza una maschera fotolitografica che ha il compito di coprire tutte le posizioni che non devono essere "deprotette" e, viceversa, lasciare scoperte quelle che devono essere sbloccate.


quindi questo procediento dovrebbe essere quello che riguarda la sintesi di oligonucleotidi in situ, giusto? mentre un altro metodo dovrebbe essere quello di caricare DNA per capillarità su un ago che ogni volta rilascia DNA nella posizione specifica viene lavato e ricaricato con altro DNA da rilasciare nella posizione adiacente....è corretto?
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lizard16
Nuovo Arrivato



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Inserito il - 24 giugno 2009 : 15:34:27  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di lizard16 Invia a lizard16 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Sì in questo caso gli oligonucleotidi sono sintetizzati in situ...per quanto riguarda l'altro metodo non sono sicuro, ma dovrebbe essere così...
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