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silvietta82
Utente Junior
126 Messaggi |
 Inserito il - 28 giugno 2009 : 19:50:37
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Ciao, qualcuno può spiegarmi la differenza tra Knock down e Knock out!!??
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zerhos
Utente Junior
Prov.: Pisa
Città: Pisa
421 Messaggi |
Inserito il - 28 giugno 2009 : 20:36:27
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knockout sta per inattivazione di un gene x,è utilizzato quando se ne vuole studiare la funzione,della serie se il gene x manca cosa succede,che fenotipo ottengo?
per inattivarlo "basta" inserire una sequenza di DNA esogeno nel gene di interesse,questa squenza ad esempio può inserirsi in un esone fondamentale determinado l'inattività della proteina codificata.l'inserzione avviene attraverso ricombinazione omologa e in genere inserisci un gene per la resistenza antibiotica come NEO,la cui espressione significa che è avvenuta integrazione.
per knock-down si intende un abbassamento dell'espressione del trascritto,in genere si ricorrono a regolazioni post-trascrizionali,ti rimando a questo link
http://en.wikipedia.org/wiki/Gene_knockdown
e cmq avrei una domanda anche io,vediamo se rispondete anche a me :D
parlando sempre di gene-targheting,faccio il mio knock-out,e utilizzo selezione positiva e negativa...se non sbaglio sia NEO che TK li sistemo sotto un forte promotore,per farli esprimere.
l'espressione di NEO mi dice che c è stata integrazione
l assenza di TK,mi dice che è avvenuta per ric. omologa
ma così non so se magari posso aver ottenuto dei falsi positivi!
cioè non risco a discriminare se la ricombinazione omologa è avvenuta effettivamente nel gene che voglio,inattivandolo.
......è per questo che dopo verifico tutto con la PCR...VERO? |
"l'unica differenza tra me e un pazzo è che io non sono pazzo!"
Salvador.Dalì
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
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zerhos
Utente Junior
Prov.: Pisa
Città: Pisa
421 Messaggi |
Inserito il - 29 giugno 2009 : 00:30:48
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grazie mille!!
ho letto il link e anche il link nel link :D,ma non si parla affatto dei promotori davanti a neo e a tk.
questo è il costrutto lineare che intendo io:
----HOMOLOGIA--prFORTE+NEO+POLI-A--HOMOLOGIA--prFORTE+tk+poli-A---
è sbagliato?
e scusa la mia ignoranza senza fondo,un altro dubbio che mi perseguita è sulle metodiche trapping.SPERIAMO che questi chiarimenti siano di aiuto anche ad altri :D
ho trovato scritto che per un gene-trap si fa il classico construtto SA--REPORTER--POLY-A.MA anche(sempre di gene-trap si parla) per evitare che l'integrazione avvenga in regioni geniche trascrizionalmente non attive,al posto dell SA,ci mettiamo un bel promotore così il reporter si esprime comunque.
domande:
1) il fatto che noi ci mettiamo un promotore non lo farebbe divenire un enhancer trap?,oppure il promotore che noi aggiungiamo è "forte", al contrario di quelli minimi(tipo TATA) che si aggiungono nell enhacer-trap?ma la faccenda comunque non torna perchè se aggiungo un promotore forte,posso rischiare che il costrtto si integra nel DNA selfish e la GFP viene comunque espressa ....
DOMANDA piu generica:
quasi tutte le reviews che ho letto usano come marker il beta-geo,negli appunti del mio prof compare solo GFP e data la piccola discrepanza,chiedevo se il loro uso è arbitrario oppure uno è meglio dell' altro a seconda dei casi? |
"l'unica differenza tra me e un pazzo è che io non sono pazzo!"
Salvador.Dalì
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silvietta82
Utente Junior
126 Messaggi |
Inserito il - 29 giugno 2009 : 01:18:32
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grazie a tutti!
Neo lo inserisci nella cassetta del gene d'interesse (quindi anche Neo è interposto, insieme al gene che vuoi sostituire,tra i siti di ricombinazione) cosicchè ovunque si sia integrato il gene (per ric omologa o integrazione) le cell sono resistenti alla neomicina. Invece TK è posto in prossimità di un sito di ricombinazione, ma non interposto tra i due, quindi tk viene integrato solo quando non c'è ric omologa e queste cel saranno sensibili al ganciclovir mentre quelle ricombinate sopravvivono...quindi in realtà dovrebbero essere già selezionati i ricombinanti aggiungendo al terreno il ganciclovir...
Il resto non saprei
Buonanotte |
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zerhos
Utente Junior
Prov.: Pisa
Città: Pisa
421 Messaggi |
Inserito il - 29 giugno 2009 : 02:54:20
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sisi silvietta questo mi era chiaro,è la faccenda dei promotori che mi rimane un po sfuggevole :(
grazie comunque! |
"l'unica differenza tra me e un pazzo è che io non sono pazzo!"
Salvador.Dalì
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 29 giugno 2009 : 22:22:52
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Citazione:
Messaggio inserito da zerhos
grazie mille!!
ho letto il link e anche il link nel link :D,ma non si parla affatto dei promotori davanti a neo e a tk.
questo è il costrutto lineare che intendo io:
----HOMOLOGIA--prFORTE+NEO+POLI-A--HOMOLOGIA--prFORTE+tk+poli-A---
è sbagliato?
No diciamo che in linea generale è giusto!
In genere si usa un promotore forte come PGK.
Citazione:
Messaggio inserito da zerhos
ho trovato scritto che per un gene-trap si fa il classico construtto SA--REPORTER--POLY-A.MA anche(sempre di gene-trap si parla) per evitare che l'integrazione avvenga in regioni geniche trascrizionalmente non attive,al posto dell SA,ci mettiamo un bel promotore così il reporter si esprime comunque.
Esistono vari tipi di gene trapping.
Citazione:
Messaggio inserito da zerhos
domande:
1) il fatto che noi ci mettiamo un promotore non lo farebbe divenire un enhancer trap?,oppure il promotore che noi aggiungiamo è "forte", al contrario di quelli minimi(tipo TATA) che si aggiungono nell enhacer-trap?ma la faccenda comunque non torna perchè se aggiungo un promotore forte,posso rischiare che il costrtto si integra nel DNA selfish e la GFP viene comunque espressa ....
Si è un promotore forte, in modo che venga sicuramente espresso.
Manca il poly-A quindi funziona solo se si integra all'interno di un gene (comunque è il poly-A trapping)
Citazione:
Messaggio inserito da zerhos
DOMANDA piu generica:
quasi tutte le reviews che ho letto usano come marker il beta-geo,negli appunti del mio prof compare solo GFP e data la piccola discrepanza,chiedevo se il loro uso è arbitrario oppure uno è meglio dell' altro a seconda dei casi?
mmm... comunque l'idea di base non cambia, si utilizza un reporter.
Credo sia una questione di comodità, in effetti anch'io ho sempre visto beta-geo, ma la cosa fondamentale è che il concetto è quello.
Qua trovi una presentazione dove sono schematizzati i vari costrutti per gene trapping: http://www.uniroma2.it/didattica/ORGANISMITRANSGENICI/deposito/LEZ2_9Aprile.ppt
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zerhos
Utente Junior
Prov.: Pisa
Città: Pisa
421 Messaggi |
Inserito il - 29 giugno 2009 : 23:38:15
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oddio il poly-A trapping,mi era sfuggito di mente....
cmq grazie mi hai tolto qualche dubbio che mi assillava!! |
"l'unica differenza tra me e un pazzo è che io non sono pazzo!"
Salvador.Dalì
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Knock down e knock out
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