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elving
Utente Junior
240 Messaggi |
 Inserito il - 02 luglio 2009 : 18:40:10
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ho letto ovunque che è un ibrido tra FISH e PCR, ma non capisco come funziona!!
aiuto...lunedì ho l'esame!!
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
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elving
Utente Junior
240 Messaggi |
Inserito il - 02 luglio 2009 : 21:04:32
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la funzione cerca l'ho usata, ma non capisco ancora che utilità abbia...perchè usare due sonde che vengono poi unite invece che una sola?
in pratica è una PCR con un primer molto lungo, formato da due sonde che si legano insieme??
dicono che ha anoalogie con la FISH..in pratica ha sono i fluorocromi di analogo, poi è tutto differente..o sbaglio? |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 02 luglio 2009 : 23:50:33
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Beh mi sembrava spiegato bene nel primo link e dalle figure del lavoro indicato da chick80.
Citazione:
ma non capisco ancora che utilità abbia...perchè usare due sonde che vengono poi unite invece che una sola?
Comunque con usa solo sonda non funzionerebbe!
Tutto il metodo è basato sul fatto che le due sonde vengono legate dalla ligasi.
Poi con una sonda sola dovrebbero essere tutte di lunghezza diversa per discriminare in base al peso, e questo creerebbe problemi all'appaiamento, non avrebbero tutte la stessa Tm.
Citazione:
in pratica è una PCR con un primer molto lungo, formato da due sonde che si legano insieme??
no è una delle 2 sonde che è molto lunga!
Le due sonde legate assieme non sono il primer ma lo stampo su cui avviene la PCR, i primers si appaiano alle code delle sonde, la parte finale che non si appaia con il gene.
chick80 è stato anche a fare il disegnino nell'altro post (che copio spudoratamente!  )
P1 ---P2 P1 ---P2 P1 ---P2
\ / \ / \ /
aaaaaa aaaaaaa bbbbb bbbbbb ccccccc ccccccc
----AAAAAAAAAAAAAA-------------------------BBBBBBBBBBBB----------------CCCCCCCCCCCCCCC------
quelli indicati con P1 e P2 sono le sequenze della sonda a cui si appaieranno i primers.
Citazione:
dicono che ha anoalogie con la FISH..in pratica ha sono i fluorocromi di analogo, poi è tutto differente..o sbaglio?
beh hai sempre una sonda che si appaia e che però non è marcata, ma è uno dei primer ad essere marcato, poi il resto è fatto con la PCR.
Ma più che cercare le analogie credo che sia importante che tu capisca come funziona la tecnica.
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elving
Utente Junior
240 Messaggi |
Inserito il - 03 luglio 2009 : 00:27:58
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grazie...mi era sfuggita la parte delle code ce non si appaiano con il gene!!
non avevo capito proprio niente...sarà che non dormo da una settimana per questo maledetto esame...decine di sindromi e molte più tecniche...
comunque, per la storia della marcatura, nel mio libro c'è scritto che sono i nucleotidi ad essere marcati. ma magari queste cose variano da protocollo a protocollo...
quindi, ricapitolando:
ho due sonde che si appaiano molto vicine, le cui estremità prossimali non sono complementari al gene e quindi restano libere.
sempre durante la fase di annealing, a queste due codine si legano i primers, mentre la ligasi salda le due sonde.
poi si ha una PCR normale che usa l'oligo prodotto dall'unione delle due sonde come stampo.
spero di averci azzeccato sta volta...
ma vedi un po' tu..che brutta figura che ho fatto!!
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elving
Utente Junior
240 Messaggi |
Inserito il - 03 luglio 2009 : 00:36:16
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Citazione:
non avrebbero tutte la stessa Tm
aspetta..quindi tutte le sonde sono uguali come lunghezza e siili come rapporto AT/CG, giusto?
quindi può capitare che le due sonde vanno ad appaiarsi leggermente distanti tra loro, tipo 3-4 nucleotidi?
...
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MLPA...ma cos'è??
