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Luis 22
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Baricalcio
Città: Bari


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Inserito il - 28 maggio 2006 : 01:29:34  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Luis 22  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Luis 22  Invia a Luis 22 un messaggio Yahoo! Invia a Luis 22 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ho una serie di quesiti su un protocollo effettuato in laboratorio.
L'esperienza consiste in parole povere:
- partire da 2 piastre di fibroblasti
- stressarne una col DEM che blocca il glutatione
- staccare e lisare le cellule con tripsina
- centrifugare ed ottenere pellet con il lisato cellulare
- effettuare un dosaggio proteico
- trattare con acido sulfosalicilico per far precipitare tutte le proteine tranne il glutatione, la cui ossidazione viene anche prevenuta
- dosare il glutatione con il DTNB sia a livello del campione (cellule stressate), sia del controllo.

Ora, vediamo i problemi:

- dosaggio proteico allo spettrofotometro --> usiamo albumina a [] nota per calcolare epsilon che poi usiamo per risalire alla [] delle proteine incognite.
Nella cuvetta inseriamo 1 ml di Bradford + 2 microlitri di campione e la [] viene espressa in mg/ml.
Ottenuto questo valore di [], ci dicono di dividerlo per 2, poichè dobbiamo riferirlo ad un microlitro, ma sinceramente, trattandosi di una [] e non di una massa, questo passaggio non riesco a spiegarmelo.

- dosaggio del glutatione: per valutare lo stress ossidativo, si dovrebbe valutare il rapporto tra forma ridotta e forma ossidata.
Ma in questa esperienza, il DTNB, legandosi al glutatione ridotto, ci permette un dosaggio appunto della forma ridotta. Eppure, sul protocollo si dice che si sta facendo un dosaggio totale.
Quindi chiedo: come si dovrebbe effettivamente fare un dosaggio della forma ridotta e di quella totale? C'entra per caso l'uso dell'acido sulfosalicilico?











La vita e i sogni sono fogli di uno stesso libro. Leggerli in ordine è vivere, sfogliarli a caso è sognare. (Arthur Schopenhauer)&

chick80
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DNA

Città: Edinburgh


11491 Messaggi

Inserito il - 28 maggio 2006 : 02:38:45  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Forse perche' nella retta di taratura avete usato 1 microlitro di albumina?

Per il glutatione non saprei... non conosco il saggio

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Luis 22
Utente

Baricalcio

Città: Bari


755 Messaggi

Inserito il - 28 maggio 2006 : 18:11:06  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Luis 22  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Luis 22  Invia a Luis 22 un messaggio Yahoo! Invia a Luis 22 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da chick80

Forse perche' nella retta di taratura avete usato 1 microlitro di albumina?




A saperlo...
Ci avevano già preparato la cuvetta con l'albumina!




La vita e i sogni sono fogli di uno stesso libro. Leggerli in ordine è vivere, sfogliarli a caso è sognare. (Arthur Schopenhauer)&
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Luis 22
Utente

Baricalcio

Città: Bari


755 Messaggi

Inserito il - 07 giugno 2006 : 00:44:13  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Luis 22  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Luis 22  Invia a Luis 22 un messaggio Yahoo! Invia a Luis 22 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da chick80

Forse perche' nella retta di taratura avete usato 1 microlitro di albumina?




Mi spiegheresti meglio la questione?
Vorrei avere una conferma ad una mia idea!
Ti ringrazio!



La vita e i sogni sono fogli di uno stesso libro. Leggerli in ordine è vivere, sfogliarli a caso è sognare. (Arthur Schopenhauer)&
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chick80
Moderatore

DNA

Città: Edinburgh


11491 Messaggi

Inserito il - 07 giugno 2006 : 02:09:31  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
L'idea è che se i tuoi 2 µl di campione assorbono come 1 µl di albumina ad una certa concentrazione, vuol dire che il tuo campione ha metà della concentrazione...

Guarda anche questo post:
http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=1378

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Uruclef
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Inserito il - 29 giugno 2006 : 09:23:26  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Uruclef Invia a Uruclef un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Scusate, forse sbaglio io.. ma il saggio Bradford non si esegue mettendo in un grafico l'assorbanza e i µg di proteine utilizzate, allo scopo di allestire la retta di taratura? Nei laboratori che ho seguito abbiamo utilizzato lo stesso procedimento, cioé con 2 µl e dividendo per due per ottenere la concentrazione. In effetti a pensarci, se si allestisse lo stesso grafico con però µg/ml non sarebbe necessario dividere.
Anche perché se dal grafico ottieni la [] dall'assorbanza in pratica hai la [] di proteine riferita a tutto l'ml della cuvetta.

Spero di non aver scritto troppe vaccate :D
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chick80
Moderatore

DNA

Città: Edinburgh


11491 Messaggi

Inserito il - 29 giugno 2006 : 09:51:55  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Si puo' fare sia assorb vs. µg/ml che assorb vs µg, anche perche' in generale nella tua retta di taratura metti sempre lo stesso volume di albumina in tutti i punti, quindi la retta sara` la stessa.

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Uruclef
Nuovo Arrivato




7 Messaggi

Inserito il - 30 giugno 2006 : 10:21:58  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Uruclef Invia a Uruclef un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Beh, non é detto: noi in lab avevamo una soluzione a [] nota e variavamo il volume da introdurre nelle varie cuvette
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chick80
Moderatore

DNA

Città: Edinburgh


11491 Messaggi

Inserito il - 30 giugno 2006 : 11:15:11  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ah ok... in quel caso hai ragione!

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