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laura85
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106 Messaggi

Inserito il - 11 giugno 2006 : 12:31:25  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di laura85 Invia a laura85 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao a tutti!
sto preparando l'esame di genomica ma non capisco una cosa:
per costruire una mappa fisica del genoma umano è necessario l'assemblaggio di una serie di frammenti di dna clonati, che si sovrappongo...al fine di prevenire lacune, una volta che li ricostruisco
insieme..e qua ci sono...vi chiedo però:
per avere questi frammenti e far sì che essi siano sovrapposti l'uno all'altro (per un tot di basi) come faccio?...faccio una digestione parziale con diversi tipi di enzimi di restrizione??
IN CHE SENSO SI SOVRAPPONGONO E COME FANNO???
NON RIESCO A FARMI L'IMMAGONE MENTALE INSOMMA...
helpp...non capisco....ho le idee confuse...uffaaa

second question:
come avviene la tecnica del chromosome walking???
sono in paranoia...aiuto!!
grazie a tutti
ciaoo

chick80
Moderatore

DNA

Città: Edinburgh


11491 Messaggi

Inserito il - 11 giugno 2006 : 12:50:31  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=201
http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=1528
http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=934

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laura85
Nuovo Arrivato




106 Messaggi

Inserito il - 11 giugno 2006 : 18:04:41  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di laura85 Invia a laura85 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ma come può un unico enzima di restrizione creare frammenti diversi e sovrapponibile, se le molecole di dna che sottopongo a digestione parziale sono tutte uguali?
non avrei invece frammenti tutti uguali?
mi sono spiegata?? spero di si
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dallolio_gm
Moderatore


Prov.: Bo!
Città: Barcelona/Bologna


2445 Messaggi

Inserito il - 11 giugno 2006 : 18:15:04  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di dallolio_gm  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di dallolio_gm Invia a dallolio_gm un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ciao!
Dipende dalla tecnica, ma bisogna usare perlomeno due enzimi di restrizione diversi.
Altrimenti si possono utilizzare mezzi di frammentazione fisici: immagina di prendere una coltura di cellule uguali e di frammentare il loro genoma: in ognuna si origineranno frammenti con sequenza e lunghezza diversi.
Almeno questo e' quello che ho capito.

Il mio blog di bioinformatics (inglese): BioinfoBlog
Sono un po' lento a rispondere, posso tardare anche qualche giorno... ma abbiate fede! :-)
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laura85
Nuovo Arrivato




106 Messaggi

Inserito il - 11 giugno 2006 : 18:32:43  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di laura85 Invia a laura85 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ah ecco mi sembrava strano.....ho ragione io che se uso un solo enzima di restrizione i frammmenti creati sono sempre gli stessi...con due è diverso....grazieeeeeeeeeee
ciaooo
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Patrizio
Moderatore

mago

Città: Vancouver


1899 Messaggi

Inserito il - 11 giugno 2006 : 21:35:09  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Patrizio  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Patrizio Invia a Patrizio un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
anche con un solo enzima si possono ottenere frammenti diversi,tipo con Sau3AI ,e' un enzima di restrizione a taglio frequente e poi il numero di frammenti prodotti dipende anche dalle condizioni di reazione e da quanto tempo lasci reagire l enzima
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chick80
Moderatore

DNA

Città: Edinburgh


11491 Messaggi

Inserito il - 12 giugno 2006 : 01:17:12  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
In generale con qualsiasi enzima puoi ottenere frammenti diversi, basta fare una digestione parziale.

Ad es. se hai 5 siti di taglio puoi digerire il campione parzialmente e una volta taglierai ad es. sul sito 1,3 e 5 l'altra volta su 2, 4 e 5 etc.
Da cui, frammenti sovrapponibili con un solo enzima!

Poi ovviamente alla Celera avranno avuto sistemi un pochino più sofisticati, ma l'idea è questa!

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laura85
Nuovo Arrivato




106 Messaggi

Inserito il - 12 giugno 2006 : 10:18:29  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di laura85 Invia a laura85 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ora è chiaro!!
grazieee e scusatemi!!siete molto gentili!!
ciauz
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Marshepherd
Nuovo Arrivato

io



22 Messaggi

Inserito il - 02 aprile 2014 : 20:12:08  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Marshepherd Invia a Marshepherd un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao a tutti, spero davvero che qualcuno possa aiutarmi, perchè non ci sto capendo niente riguardo questa tecnica!

io vorrei capire passo passo come funziona il walking,
allora partiamo da una genoteca giusto?!
ad esempio una genocheca costruita con l'enzima Pst, quindi io ho una capsula petri (una per semplicità, in realtà saranno molte di più) dove ci sono tutti i miei cloni ognuno dei quali avrà un frammento di DNA taliato con le digestioni parziali con Pst introdotto in essi grazie ad un vettore, giusto??

A questo punto devo effettuare altre digstioni con enzimi diversi, ad esempio Sal Kpn Bste2 ecc

-primo intoppo- : la digestione singolo per ogniuno di questi enzimi si fa sul genoma per intero??

andiamo avanti, effettuo digestioni doppie dove uno dei due enzimi è Pst (l'enzima con cui ho costruito la genoteca) quindi, io ho pensato, sicuramente sia le digestioni doppie che singole le faccio su tutto il genoma! corretto?? -mini secondo intoppo-

procedendo, ho una serie di frammenti ottenuti dalle digestioni singole e dalle doppie, e mi chiedo a cosa mi serve allora la genoteca?? -terzo dubbio-

i frammenti vengono separati mediante elettroforesi, quindi
mi produco dei filtri mediante Southern blot, -quarto intoppo- perchè ottengo tanti filtri quanti sono i cloni?? i frammenti non sono già liberi???


va beh, facciamo finta che ho capito, quindi con i filtri ottenuti faccio una ibridazione, con sonde radioattive per ottenere varie autoradiografie dei filtri. -quinto intoppo, legato al quarto- perchè ho tante radiografie??? da dove escono queste radiografie diverse, nell'elettroforesi non metto in ogni pozzetto un'aliquota per ogni tipo di digestione?

Aiutooooooooooooooooooooooooooooooo

Vi prego abbiate pietà di me!!!! sul libro non trovo niente, non c'è proprio questa tecnica! su internet, peggio di peggio...
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