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CRISTIAN
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92 Messaggi

Inserito il - 13 settembre 2006 : 09:26:35  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di CRISTIAN Invia a CRISTIAN un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
PER LS CLONAZIONE IN pcDNA3 (clonazione in cellule di mammifero)il protocollo dice di inserire il gene solamente dalla ORF fino al codone di stop. Secondo voi è necessario oppure si possono mettere anche alcune basi prima dell'ORF e dopo il codone di stop??

GRAZIE
Cristian

GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8380 Messaggi

Inserito il - 13 settembre 2006 : 10:00:28  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
il protocollo dice di inserire il gene solamente dalla ORF fino al codone di stop

Scusa Cristian dove l'hai letto???
Il protocollo che ho io e che ti allego dice questo:
Citazione:
Cloning Considerations
pcDNA3.1(+) and pcDNA3.1(-) are nonfusion vectors. Your insert must contain a Kozak translation initiation sequence and an ATG start codon for proper initiation of translation (Kozak, 1987; Kozak, 1991; Kozak, 1990). An example of a Kozak consensus sequence is provided below. Please note that other sequences are possible (see references above), but the G or A at position -3 and the G at position +4 are the most critical for function (shown in bold). The ATG initiation codon is shown underlined.
(G/A)NNATGG
Your insert must also contain a stop codon for proper termination of your gene. Please note that the Xba I site contains an internal stop codon (TCTAGA).

è necessario che tu inserisca prima dell'ATG di inizio la sequenza di KozaK per un corretto inizio della traduzione e che alla fine ci sia il codone di stop (ovviamente altrimenti la traduzione non si ferma e verrebbe tradotto anche un pezzo di vettore!)

Poi se hai bisogno di inserire altre basi prima e dopo che ti servono per la clonazione non ci sono problemi! (a meno che tu non inserisca prima della ORF un'altro ATG di inizio che potrebbe portarti ad un inizio di traduzione sbagliato)


Allegato: pcdna3.1_man.pdf
258,43 KB
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CRISTIAN
Nuovo Arrivato



92 Messaggi

Inserito il - 13 settembre 2006 : 10:16:16  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di CRISTIAN Invia a CRISTIAN un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
se guardi questo pdf è spiegato il disegno dei primer(pag 4-6) e a me sembra così..ma potrei sbagliarmi..fammi sapere.



Allegato: pcdna3_1dv5histopo_man.pdf
533,33 KB


GRAZIE MILLE
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CRISTIAN
Nuovo Arrivato



92 Messaggi

Inserito il - 13 settembre 2006 : 10:21:05  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di CRISTIAN Invia a CRISTIAN un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
inoltre nel mio caso la sequenza di kozak è già presente dopo l'ATG dell'ORF..
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8380 Messaggi

Inserito il - 13 settembre 2006 : 12:28:27  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao Cristian,
io ho clonato nel vettore pENTR/D-TOPO ho confrontato il mio protocollo (pENTR Directional TOPO Cloning Kits ) con il tuo per pcDNA3 (pcDNA3.1 Directional TOPO Expression Kit) e il capitolo “Designing PCR Primers” è praticamente identico.
(La differenza è che il mio vettore è un entry vector e poi per esprimere la proteina in mammifero devo riclonarlo in un destination vector mentre il tuo è già un destination vector)

Comunque riguardo il disegno dei primers dipende cosa devi fare, cioè se devi esprimere la proteina così com’è o in fusione con un’altra.
Per il forward primer:
- devi inserire la sequenza “CACC” che ti serve per clonare utilizzando la topoisomerasi (TOPO Cloning) come ti spiega il protocollo
- devi inserire la sequenza di kozak: se hai già inserito “CACC” + “ATG” di inizio sei già a posto: C“ACCATG” (tra virgolette è la sequenza di kozak)
- poi metti la sequenza complementare al tuo gene

ad. es la tua sequenza è ATG GTT CAG…
il tuo primer sarà CACC ATG GTT CAG…

detto così sembra facile però può darsi che il primer poi non sia “il massimo” e che non vada benissimo con il reverse, ma devi cercare di raggiungere una sorta di compromesso e cercare di disegnare i primers migliori possibili rispettando queste regole.
Comunque non è obbligatorio che il CACC faccia parte della sequenza kozak puoi anche disegnare ad es il primer così:
CACC NNACC ATG…
se ti aiuta ad avere un primer migliore.

- per il reverse è più semplice devi solo inserire o meno il “codone di stop” a secondo che tu debba esprimere la proteina da solo o una proteina di fusione.
Poi dopo il codone di stop puoi metterci quello che vuoi, tanto non viene tradotto!
Ah dimenticavo devi però fare attenzione a non inserire la sequenza complementare al “GTGG” al 5 del tuo primer altrimenti rischi che si inserisca al contrario (il reverse non deve finire con CCAC!)


Se però invece di inserire il frammento sfruttando la topoisomerasi lo vuoi inserire mediante clonaggio con enzimi di restrizione (come mi sembrava di aver capito da un tuo post precedente http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=1972 ) questo non ti serve.

Spero di aver chiarito i tuoi dubbi!
Prova a disegnare i primers e fammi sapere se hai problemi
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CRISTIAN
Nuovo Arrivato



92 Messaggi

Inserito il - 13 settembre 2006 : 15:13:36  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di CRISTIAN Invia a CRISTIAN un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
CIAO GRAZIE MILLE SEI MOLTO GENTILE, VISTO CHE HAI CAPITO FORSE ANCHE MEGLIO DI ME TI ALLEGO LA MIA SEQUENZA E I PRIMER CHE HO TROVATO: SENSO CACCatgaattcactcagtgaagcca e ANTISENSO GCAATCAGTTTACCAGAACATCTGCAG. IL PRIMO ATG(SECONDA BASE) è L'ORF E IL CODONE DI STOP FINISCE COSì:CCCCGTAG

Allegato: scca in pet21a.doc
21,44 KB
VANNO BENE? IL SENSO è A POSTO CON KOZAK?
gRAZIE INFINITE
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8380 Messaggi

Inserito il - 13 settembre 2006 : 16:48:46  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ok gli do un occhiata, purtroppo però il computer che sto usando al momento non ha il programma per i primers. Ma ti prometto che al più presto li controllo sull'altro computer.
Magari poi ti invio l'analisi per mail!

Solo una domanda: ho dato un'occhiatina veloce ma non ho capito il primer reverse dove si dovrebbe attaccare sulla tua sequenza!
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CRISTIAN
Nuovo Arrivato



92 Messaggi

Inserito il - 13 settembre 2006 : 17:29:35  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di CRISTIAN Invia a CRISTIAN un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
il senso dovrebbe iniziare proprio dalla prima base ma ho dovuto aggiungere la sequenza CACC che servirà per il vettore direzionale.
l'unico problema è che non saprei come fare per Kozak visto che non c'è nella mia sequenza. Anche il senso non è il massimo ma devo farlo partire per forza da quel punto perchè il primo ATG è prorio l'ORF.
la mia mail è turaz@katamail.com
Grazie infinite
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8380 Messaggi

Inserito il - 13 settembre 2006 : 18:24:07  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
non saprei come fare per Kozak visto che non c'è nella mia sequenza


Come non c'è nella tua sequenza? C'è, c'è non ti preoccupare!
L'unica cosa che ti manca è la "G" dopo l'ATG... ma quella non puoi averla perchè il tuo primo codone dopo ATG è AAT. Ma non ti devi preoccupare per questo, funziona lo stesso (altrimenti come si farebbe in tutti i casi in cui il secondo codone non inizia con G?)
la sequenza Kozak base è: ACCATG"G" e quella più completa è (GCC)RCCATG"G"
a parte la "G" dopo l'ATG hai:
ACCATG (base)
(GCC)RCCATG (completa)
tu hai: CCACATG
sei a posto!

Comunque per il senso ci siamo!
Quello che non capisco dove si attacca alla sequenza che mi hai mandato è l'antisenso!

Comunque dormici un po' su e vedrai che domani ti sembrerà tutto più chiaro!
Cerco di farti avere per domani l'analisi dei primers!

Ciao
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Patrizio
Moderatore

mago

Città: Vancouver


1899 Messaggi

Inserito il - 13 settembre 2006 : 22:23:41  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Patrizio  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Patrizio Invia a Patrizio un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Inserire la sequenza Kozak,è sicuramente una pratica che viene compiuta di routine nei laboratori in quanto fornisce ottimi risultati, specialmente in esperimenti di sintesi proteica in vitro mediante l'utilizzo di sistemi reticolocitari. Dalla mia esperienza comunque posso affermare che i contesti naturali dei codoni di inizio della traduzione mi hanno dato sempre buoni risulatati e non e' stato necessario migliorarli(la natura non fa mai niente per niente).
P.S.: puoi tranquillamente inserire tutte le basi che vuoi, a monte o a valle della tua ORF; l'importante che non ci siano ATG a monte della sequenza clonata e che a valle ci sia sempre il tuo codone di stop.
buona fortuna
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CRISTIAN
Nuovo Arrivato



92 Messaggi

Inserito il - 14 settembre 2006 : 10:25:49  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di CRISTIAN Invia a CRISTIAN un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
l'antisenso è in direz 5' 3' ma complementare all'ultima base..inizia proprio dall'ultima base della sequenza
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8380 Messaggi

Inserito il - 14 settembre 2006 : 11:27:45  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ok l'ho trovato il reverse, dando un'occhiata veloce non l'avevo visto comunque ti ho mandato l'analisi per mail!

Per Patrizio è vero che la traduzione funziona comunque anche se non si introduce la sequenza di Kozak, però questa aiuta a migliorarne l'efficienza, tutto qua.
Citazione:
(la natura non fa mai niente per niente).

è vero ma non stiamo parlando di un contesto naturale, ma di una modificazione attuata dall'uomo, "un plasmide inserito in cellule di mammifero"
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CRISTIAN
Nuovo Arrivato



92 Messaggi

Inserito il - 14 settembre 2006 : 12:39:50  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di CRISTIAN Invia a CRISTIAN un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
GRAZIE MA NON HO RICEVUTO LA MAIL. TI RIPETO L'INDIRIZZO:
TURAZ@KATAMAIL.COM
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8380 Messaggi

Inserito il - 14 settembre 2006 : 15:22:11  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
L'ho mandata anche a me per conferma e a me arriva l'allegato!

Comuque provo a metterlo anche qui!



Allegato: Analisi Primers 2.pdf
22,38 KB
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CRISTIAN
Nuovo Arrivato



92 Messaggi

Inserito il - 14 settembre 2006 : 16:46:33  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di CRISTIAN Invia a CRISTIAN un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
GRAZIE INFINITE
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Patrizio
Moderatore

mago

Città: Vancouver


1899 Messaggi

Inserito il - 14 settembre 2006 : 19:35:15  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Patrizio  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Patrizio Invia a Patrizio un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
per GFPina.
Già il tuo nome è tutto un programma, e sicuramente i vettori di clonaggio per te non sono un mistero. ma vorrei puntualizzare che io ho parlato del sistema reticolocitario che è tutta un altra storia rispetto alle espressioni di costrutti genici in cellule di mammifero. Cmq non essendo sempre possibile aggiungere la sequenza Kozak (in particolare in posizione +4)consiglio vivamente di agire più sulla trascrizione che sulla traduzione (esistono delle regioni 5'UTR capaci di favorire la traduzione più di qualsiasi altro artificio genico).
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8380 Messaggi

Inserito il - 15 settembre 2006 : 14:58:51  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Scusa…
in effetti non avevo capito che ti riferivi al sistema reticolocitario e concordo che sia tutta un’altra cosa!
Avevo interpretato male!
Citazione:
consiglio vivamente di agire più sulla trascrizione che sulla traduzione (esistono delle regioni 5'UTR capaci di favorire la traduzione più di qualsiasi altro artificio genico).

Concordo… però mi aspetto che utilizzando dei vettori commerciali (che ormai sono altamente ingenierizzati) questo sia già compreso nel vettore!
(Altrimenti mi incavolerei con la ditta che me lo ha venduto, come purtroppo mi è già successo per altri motivi!)
Se invece dovessi costruire tutto il vettore sarebbe un altro discorso.

Per quanto riguarda l’inserimento della sequenza di kozak (che consigliano loro nel manuale del vettore), certo se si riesce ad inserire è meglio, altrimenti pazienza… funziona comunque.
(anche se mi capitato su un altro forum di leggere, scritto da un professore che consigliava vivamente ai suoi studenti di inserire la sequenza di kozak altrimenti non funzionava niente e non dovevano poi lamentarsi… mah? Sarà stato un amico di Kozak???)

Citazione:
Già il tuo nome è tutto un programma, e sicuramente i vettori di clonaggio per te non sono un mistero.

Sul mio nome TI PREGO non infierire! Era perché stavo facendo un vettore per la produzione di un topo GFP che purtroppo per condizioni indipendenti dalla mia volontà non ha mai visto la luce! E io ho buttato un anno di lavoro!!! L’unica cosa che mi è rimasta è un disegno di un topo verde sulla porta del laboratorio!
Inoltre non è vero che i vettori di clonaggio per me non sono un mistero… anzi non si finisce mai di imparare cose nuove, questo è uno dei motivi per cui frequento questo forum dove ognuno mette la sua esperienza a disposizione degli altri!

Ciao ciao
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