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Miciaglo
Nuovo Arrivato

Prov.: TV


40 Messaggi

Inserito il - 25 marzo 2011 : 13:16:56  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Miciaglo Invia a Miciaglo un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Anche qui faccio la premessa del mio topic precedente: http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=22040
Cioè spero di aver utilizzato la sezione corretta :P

Non riesco a capire come funziona questo tipo di sequenziamento del DNA riportato nelle slides del mio professore:


La mia interpretazione è che si svolge la reazione in 4 provette differenti, ognuna che contiene un diverso nucleotide.
Poi purtroppo non so come spiegare il resto.. Cosa voglion dire le sequenze a fianco di "prodotti di dna"?
come giungo ai risultati dell'elettroforesi?

Riporto la didascalia messa nella slide che spiega la procedura (da me non compresa a fondo):

Citazione:
1.Si marcano 4 tubi separati (A,C,G,T). Ogni tubo contiene una diversa miscela per la reazione di sintesi interrotta del DNA:dATP+ddATP, dCTP+ddCTP etc
2.Si denatura il DNA stampo in presenza di un oligo radioattivo.
3.Si aggiungono DNA stampo e oligo in ciascun tubo e si lascia procedere la reazione di sintesi del DNA per alcuni minuti.
4.Si separano i prodotti della reazione con la tecnica dell’elettroforesi su gel di poliacrilamide.
5.Dopo aver seccato il gel, si espone in contatto con una lastra fotografica per autoradiografia.
6.Si sviluppa la lastra fotografica e si visualizzano le bande
7.Leggendo l’autoradiogrammasi deduce la sequenza di DNA dell’inserto clonato.


grazie :)

domi84
Moderatore

Smile3D

Città: Glasgow


1700 Messaggi

Inserito il - 25 marzo 2011 : 16:23:29  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di domi84 Invia a domi84 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
i ddATP/CTP/GTP/TGP sono dideossinucleotidi e si usano per stoppare le reazioni di PCR perchè manca l'OH al 3'.

Quindi nella mix 1 hai dATP e ddATP, normalmente viene inserito dATP qualche volta il ddATP che blocca la crescita della catena.
Questo per ogni mix.
Alla fine le corri sul gel, siccome ci saranno frammenti di lunghezza diversa riesci a...sequenziare.
Non so se sono stato chiaro.

Il mio blog: http://domi84.blogspot.com/
Le foto che ho scattato...
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Miciaglo
Nuovo Arrivato

Prov.: TV


40 Messaggi

Inserito il - 25 marzo 2011 : 19:04:37  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Miciaglo Invia a Miciaglo un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
uhm no xD
che senso ha metterci il dATP e ddATP?
poi se non ci metto un enzima di restrizione vedrò circa la stessa cosa sia se metto uno o l'altro.. no?
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8380 Messaggi

Inserito il - 25 marzo 2011 : 23:42:38  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Gli enzimi di restrizione non c'entrano proprio niente!

Innanzitutto devi capire la differenza tra dNTP e ddNTP (quello che ha spiegato Domi84)
- se viene incorporato un dNTP la polimerizzazione prosegue
- se viene incorporato un ddNTP la polimerizzazione si ferma

Tu hai questa sequenza: AGCCTAGACT
fai avvenire la reazione di polimerizzazione in 4 provette differenti in ogniuna delle quali ci saranno 3 dei nucleotidi sotto forma di dNTP e il quarto sarà una miscela di dNTP + ddNTP.
Ora devi considerare una base alla volta (quindi 1 provetta), consideriamo ad es. la A utilizzi una miscela di dATP e ddATP, mentre per le altre basi hai dNTP (dCTP, dGTP e dTTP)
hai 2 possibilità
1. viene incorporato ddATP e la reazione si stoppa subito, quindi hai un frammento con una sola base: A
2. viene incorporato dATP e la reazione continua, quindi si prosegue con le altre basi e arrivi a: AGCCT
siccome la base successiva sarebbe una A a questo punto hai ancora 2 possibilità:
1. viene incorporato ddATP e la reazione si stoppa, quindi ottieni: AGCCTA
2. viene incorporato dATP e la reazione continua, quindi si prosegue con le altre basi e arrivi a: AGCCTAG
la base successiva è ancora una A quindi hai ancora 2 possibilità:
1. viene incorporato ddATP e la reazione si stoppa, quindi ottieni: AGCCTAGA
2. viene incorporato dATP e la reazione continua, quindi si prosegue con le altre basi e arrivi a: AGCCTAGACT
quindi alla fine nella prima provetta hai una miscela di frammenti di varie lunghezze e precisamente:
1nt A
6nt AGCCTA
8nt AGCCTAGA

la stessa cosa succederà nelle altre provette con le altre basi.

A questo punto fai migrare su gel il contenuto delle 4 provette e avrai il risultato della figura.
Per stabilire la sequenza non fai altro che leggere dal basso verso l'alto:
la banda più bassa (1nt) è nel pozzetto della A, quindi la prima base è A
la seconda banda (2nt)è nel pozzetto della G, quindi la seconda base è G (AG)
la terza banda (3nt)è nel pozzetto della C, quindi la terza base è C (AGC)
la quarta banda (4nt)è nel pozzetto della C, quindi la quarta base è C (AGCC)
e così via...

ovviamente se tu nella provetta avessi avuto solo ddATP e non anche dATP la reazione si sarebbe per forze fermata (non avresti le 2 possibilità) e quindi si sarebbe fermato tutto alla prima base, non servirebbe a niente!

E' chiaro ora?

P.S. non ti preoccupare, le tue discussioni vanno benissimo sia nella sezione di Genetica che in quella di Biologia Molecolare, tu scegli sempre la sezione che ti sembra più adatta, nel caso non lo fosse provvederanno i moderatori di quella sezione a spostarla!
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Miciaglo
Nuovo Arrivato

Prov.: TV


40 Messaggi

Inserito il - 26 marzo 2011 : 15:18:40  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Miciaglo Invia a Miciaglo un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ora ho capito! grazie della spiegazione completa :*
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