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fideb
Nuovo Arrivato

DNA
Città: Potenza


54 Messaggi

Inserito il - 11 giugno 2011 : 16:35:07  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di fideb Invia a fideb un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao!ho un piccolo problema nell'amplificare il mio gene con la PFU. Inizialmente ho utilizzato la Taq ed ho ottenuto il mio amplificato. Dovendo clonare il mio gene, sono passata alla PFU. Ho seguito tutte le indicazioni nel manuale della PFU eccezion fatta per un paramentro: nel protocollo annesso dice di fare una denaturazione iniziale a 95°C per 1-2 min e poi una denaturazione a 95°C per 0.5-1 min. Io invece per una svista ho impostato 94°C per 2 min come denaturazione iniziale e 94°C per 30'' nel successivo step di denaturazione. Ciò può aver causato l'assenza di amplificato?

GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


8380 Messaggi

Inserito il - 11 giugno 2011 : 19:34:26  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Non sei né la prima né l'ultima ad avere problemi con la Pfu, in genere quello che viene con la Taq l'80% delle volte non viene con la Pfu!
E' un enzima molto esigente e devi cambiare un po' di condizioni, e il problema non è certo quel grado in meno nella denaturazione.
Guarda ad es. questa discussione: http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=10168
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fideb
Nuovo Arrivato

DNA

Città: Potenza


54 Messaggi

Inserito il - 11 giugno 2011 : 20:24:09  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di fideb Invia a fideb un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Si, avevo già dato un occhio...grazie mille!
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