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matteo991
Nuovo Arrivato
18 Messaggi |
 Inserito il - 28 giugno 2011 : 11:37:04
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Ragazzi qualcuno sa spiegarmi la curva di dissociazione (tm) della pcr ? Poi invece riguardo l'analisi dei risultati della pcr tradizionale non ho capito come poi vengono interpretati con l'agarosio e l'elettroforesi :(
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picchiasebino
Nuovo Arrivato
Città: roma
52 Messaggi |
Inserito il - 28 giugno 2011 : 16:39:45
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se fai un giro in questo sito ci molte cose a riguardo...
cmq, in breve, la Tm è quella fase delle PCR in cui avviene l'annealing tra il singolo filamento di DNA e i primers, disegnata in una PCR real-time da una sonda tipo sybergreen, per evidenziare eventuali mismatch (appaiamenti errati).
una volta finita la PCR si fanno correre i miliardi di templati di DNA prodotto in un gel (che non è altro una rete, immagina un motorino nel traffico di Roma....). se la PCR ha funzionato (se i primer hanno trovato i siti e la polimerasi ha funzionato) i templati ci sono e migrano attraverso il gel (POSITIVITA'). Viceversa sa non c'è stata amplificazione non si è prodotto DNA e nel pozzetto non migrerà nulla (NEGATIVITA') |
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 28 giugno 2011 : 16:53:23
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| Concordo con sebino, aggiungo sottolineando che l'interpretazione è strettamente legata a ciò che cerchi di verificare dalla reazione di PCR. Potresti, per esempio, caratterizzare un individuo per omozigosità/eterozigosità di un locus a seconda che nel gel compaiano una sola banda oppure due a diversa mobilità. |
So, forget Jesus. The stars died so that you could be here today.
A Universe From Nothing, Lawrence Krauss
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Martin.diagnostica
Utente Attivo
1582 Messaggi |
Inserito il - 28 giugno 2011 : 18:27:30
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Citazione:
Messaggio inserito da matteo991
Ragazzi qualcuno sa spiegarmi la curva di dissociazione (tm) della pcr ? Poi invece riguardo l'analisi dei risultati della pcr tradizionale non ho capito come poi vengono interpretati con l'agarosio e l'elettroforesi :(
si in effetti risultati del tipo qualitativo, c'è la banda, non c'è la banda. Dalle dimensioni (size) si capisce che la banda è quella giusta. Poi ci sono una infinità di possibili applicazioni, hanno scritto interi libri :D |
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matteo991
Nuovo Arrivato
18 Messaggi |
Inserito il - 28 giugno 2011 : 18:35:25
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| quindi la tm il cui picco massimo generalmente è di circa 80 gradi rappresenta il fatto che la taq ha polimerizzato metà della catena? |
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picchiasebino
Nuovo Arrivato
Città: roma
52 Messaggi |
Inserito il - 28 giugno 2011 : 19:21:22
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| no. la Tm non ha un picco massimo a 80 gradi, ma può essere anche 40, 45, 50, ecc, dipendendo da molteplici fattori, come la linghezza dei primer e da quali basi nucleotidiche è composto. la polimerizzazione (detta anche extension) avviene successivamente all'annealing dei primer. |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 28 giugno 2011 : 21:57:08
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Citazione:
Messaggio inserito da picchiasebino
cmq, in breve, la Tm è quella fase delle PCR in cui avviene l'annealing tra il singolo filamento di DNA e i primers, disegnata in una PCR real-time da una sonda tipo sybergreen, per evidenziare eventuali mismatch (appaiamenti errati).
No assolutamente!
La Tm (temperatura di Melting) è la temperatura alla quale un DNA a doppio filamento si trova per metà denaturato!
La fase della PCR dove i primers si attaccano alla sequenza bersaglio si chiama "anealing" o "appaiamento".
Ora bisogna distinguere 2 cose:
1) i PRIMERS
2) il PRODOTTO di PCR
1) I primers sono filamenti singoli che però sono complementari ad una parte della sequenza bersaglio, quindi appaiandosi formeranno con essa un doppio filamento, ovviamente quel doppio filamento avrà una sua Tm ed è importante sapere quale sia per eseguire la PCR ad una corretta temperatura di anealing (Ta). La Ta in genere è di pochi gradi sotto alla Tm, questo per garantire che il primer si appai alla sequenza. Questa è la Tm a cui si riferiva picchiasebino.
2) Il PRODOTTO di PCR è una sequenza a doppio filamento con una certa lunghezza e una certa composizione in basi, avrà quindi anch'esso una certa Tm (ovviamente maggiore rispetto a quella dei primers). Se tu prendi il prodotto di PCR dopo l'amplificazione e li incubi a temperatura crescente avrai che all'inizio sarà tutto a doppio filamento, poi inizierà a denaturarsi, arriverà ad un punto in cui sarà per metà denaturato (quella temperatura è la Tm) e poi alzando ancora la temperatura si denaturerà completamente.
Questa è una curva di melting del DNA:
Quando fai una PCR realt-time, con SYBRGreen (non con le sonde!) puoi andare a vedere la curva di melting del tuo amplificato per vedere se il prodotto che hai ottenuto è specifico, non mi dilungo perché in questa discussione: http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=2538
troverai un'ottima spiegazione di chick80, ma il senso è questo:
se tu sai che il tuo amplificato ha una Tm di 80°C ti aspetti di avere una curva che ti dia un picco a 80°C, se hai un picco ad una T diversa o hai più di un picco vuol dire che c'è qualcosa di aspecifico. (anche questo è spiegato nella discussione che ti ho linkato)
ma il senso è |
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matteo991
Nuovo Arrivato
18 Messaggi |
Inserito il - 29 giugno 2011 : 12:55:36
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| scusate che differenza c'e' tra la tm della pcr e quella dell'ibridazione molecolare? |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 29 giugno 2011 : 14:39:19
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Citazione:
Messaggio inserito da matteo991
scusate che differenza c'e' tra la tm della pcr e quella dell'ibridazione molecolare?
Non esistono la Tm della PCR e la Tm dell'ibridazione, la Tm è sempre la stessa cosa, come ho cercato di spiegarti nel post precedente, prova a rileggerlo con attenzione! |
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Discussione |
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analisi risultati pcr e curva di dissociazione
Didattica e Relazioni
