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carlo4567
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CittÓ: roma


40 Messaggi

Inserito il - 12 novembre 2006 : 09:39:39  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di carlo4567 Invia a carlo4567 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ho un p˛ di confusione in merito alla fasi del sequenziamento

Nei Procarioti credo di aver capito che si usa la Tecnica shotgun e assemblaggio diretto dei contig

Negli Eucarioti il processo richiede una mappa.
La Mappa del genoma Ú ottenuta sequenziando le estremitÓ di inserti lunghi inseriti in BAC
Alla fine del mappaggio vengono inseriti markers nella mappa.
Assemblaggio dei contig in base alla mappa.

Ho capito bene il processo?

A questo punto con tutto questo come si relazionano gli elettroferogrammi?

Grazie a chi mi potrÓ chiarire tutto il processo di sequenziamento schematicamente

chick80
Moderatore

DNA

CittÓ: Edinburgh


11491 Messaggi

Inserito il - 12 novembre 2006 : 11:08:55  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Il sequenziamento del genoma di un procariote o di un eucariote si fa in generale allo stesso modo, il fatto Ŕ che un genoma eucariote Ŕ molto pi¨ grande, quindi molto pi¨ complesso da sequenziare.

Citazione:
A questo punto con tutto questo come si relazionano gli elettroferogrammi?

Non ho capito bene questa domanda... l'elettroferogramma Ŕ effettivamente il risultato del tuo sequenziamento, quello che ti permette di dire che basi ci sono nel tuo DNA... cosa non ti torna a proposito?

Vedi anche:
http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=934
http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=1528
http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=201

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carlo4567
Nuovo Arrivato

Prov.: roma
CittÓ: roma


40 Messaggi

Inserito il - 12 novembre 2006 : 11:47:08  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di carlo4567 Invia a carlo4567 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Il fatto Ú che ho un gran casino in testa.
Partiamo dall'inizio. Creo la libreria di cloni BAC. Creo la mappa fisica sequenziando le estremitÓ dei BAC.
Prima domanda:
la mappa fisica si ottiene unendo le estremitÓ dei BAC sequenziate?
Coma faccio ad aggiungere i marcatori?

A questo punto basandomi sulla mappa unisco i contig.
Quando e con cosa leggo la sequenza di basi dei contig? Prima di unirli tra loro?
la sequenza dei contig la leggo tramite l'elettroferogramma?
I contig vengono uniti insieme con Phrap sulla base dei risultati letti con l'elettroferogramma?
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chick80
Moderatore

DNA

CittÓ: Edinburgh


11491 Messaggi

Inserito il - 13 novembre 2006 : 07:03:17  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Forse ti manca il fatto che i vari cloni hanno parti sovrapposte fra di loro

Ad es. se la tua sequenza fosse questa:


ACACTATCGATCGAGAAGCTCTAGCTTATCGATCGAT


Potresti avere 4 BAC contenenti


ACACTATCGA
      TCGATCGAGAA
              GAAGCTCTAGCTT
                        CTTATCGATCGAT 


Ovviamente in un caso come questo ├Ę facile unire il tutto in una sequenza unica, se hai centinaia di migliaia di sequenze molto pi├╣ lunghe la cosa diventa pi├╣ complessa.

E dove rientra in tutto ci├▓ l'elettroferogramma?

Beh, i vari metodi di sequenziamento (es. lo storico metodo di Sanger o quello quasi storico dei didesossi) si basano sulla creazione di sequenze uguali a quella da sequenziare ma troncate alle varie lunghezze.

Es. per la sequenza di sopra otterrai:


ACACTATCGATCGAGAAGCTCTAGCTTATCGATCGAT
ACACTATCGATCGAGAAGCTCTAGCTTATCGATCGA
ACACTATCGATCGAGAAGCTCTAGCTTATCGATCG
ACACTATCGATCGAGAAGCTCTAGCTTATCGATC
ACACTATCGATCGAGAAGCTCTAGCTTATCGAT
ACACTATCGATCGAGAAGCTCTAGCTTATCGA
ACACTATCGATCGAGAAGCTCTAGCTTATCG
ACACTATCGATCGAGAAGCTCTAGCTTATC
...
...
...


Le varie sequenze sono generate da 4 diverse reazioni che generano sequenze che finiscono tutte con la stessa base. Fai correre queste sequenze su un gel e puoi "leggere" la sequenza del DNA.

Oramai il tutto si fa in realt├á in una reazione unica con il dye sequencing e si usa l'elettroforesi capillare, ma l'idea ├Ę assolutamente la stessa.

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