PCR con Taq polimerasi high fidelity

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Autore

Discussione

Gst
Utente Junior

Prov.: Roma
Citt�: Ariccia

143 Messaggi

Inserito il - 25 agosto 2011 : 18:43:08

Ciao ragazzi

mi � venuto un dubbio vergognoso! Mi scuso in anticipo...

Se ho uno stock di dNTP 10mM, vuol dire che ogni dNTP (dCTP, dATP, etc) � concentrato 2.5mM (oppure che ogni tipo di dNTP � � 10mM?!).

Nel kit della Taq high fidelity dicono di usare i dNTP ad una concentrazione pari a 250 microM per ogni dNTP. Ci� vuol dire che (in una reazione di PCR di 50 microl) quanti microl devo mettere dello stock???

Ascoltami con gli occhi...

0barra1
Utente Senior

Citt�: Paris, VII�me arrondissement

3847 Messaggi

Inserito il - 25 agosto 2011 : 19:43:18

Lurkando sul web, leggo che

Citazione:
General PCR Protocol

Sally A. Green, 2-17-96

Materials

...

dNTPs (2mM stock)

note: a 2mM stock of dNTPs means that the final concentration of each dNTP (dATP, dCTP, dGTP, and dTTP) is 2mM -- NOT that all dNTPs together make 2mM. dNTPs come as 100mM stocks -- thaw and add 10#956;L of each dNTP to 460#956;L of ddH20 to make 2mM. Store at -20�C.

...

Perci� se devi passare da una concentrazione di 10mM a 250uM, dovrai diluire (10000/250 = ) 40x. Ci� significa che nel tuo volume finale di 50uL un quarantesimo (1/40) della soluzione � rappresentata dal tuo stock. Poich� 1/40 di 50uL � 1.25uL, questo � il volume di stock che devi aggiungere (perch� ogni dNTP sia concentrato 250mM).

So, forget Jesus. The stars died so that you could be here today.
A Universe From Nothing, Lawrence Krauss

GFPina
Moderatore

Citt�: Milano

8408 Messaggi

Inserito il - 26 agosto 2011 : 00:30:48

Come detto altre volte sul forum (ad es. qui: http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=14518) in genere una mix di dNTPs 10mM si intende 10mM di ognuno, comunque se non sulla provetta almeno sul datasheet deve essere specificato se si intend "each" o "total"

Per i conti ti ha gi� risposto 0barra1.

0barra1
Utente Senior

Citt�: Paris, VII�me arrondissement

3847 Messaggi

Inserito il - 26 agosto 2011 : 01:22:09

Come mai non hai consigliato all'utente una capatina alla pagina Principi per rinfrescarsi le idee?

Comunque te la consiglio Gst, perch� � esaustiva e ben realizzata, meglio certamente delle mie spiegazioni.

So, forget Jesus. The stars died so that you could be here today.
A Universe From Nothing, Lawrence Krauss

Gst
Utente Junior

Prov.: Roma
Citt�: Ariccia

143 Messaggi

Inserito il - 26 agosto 2011 : 17:40:09

Grazie ragazzi

esaustivi e precisi come sempre!

So che � un dubbio imperdonabile, ma noi compriamo dNTP singoli e in lab una persona fa le mix di dNTP per tutta la comunit�

quindi, non essendo scritto each o simile sulla provetta... e visto che la persona che prepara la , beata lei

� in vacanza

ho pensato di chiedere a voi!

Sul calacolo della diluizione da fare non avevo dubbi

ma grazie comunque tante tante!