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oliveroreste
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 Inserito il - 05 ottobre 2011 : 18:14:13
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ciao a tutti,
scusate la domanda banale ma sono nuova nel campo della biologia. ho estratto RNA da tessuto usando il protocollo con Trizol e in seguito ho estratto DNA. ho sentito che con questa metodica il DNA che ne risulta potrebbe essere frammentato e dovrei provare la qualità con gel. qualcuno ha qualche suggerimento e indicazione di protocollo a riguardo?
grazie
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picchiasebino
Nuovo Arrivato
Città: roma
52 Messaggi |
Inserito il - 05 ottobre 2011 : 19:33:08
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dovresti far correre il DNA tal quale colorato con un loading buffer in un gel ad es. allo 0,8% di agarosio e etidio di bromuro.
es. 10 ul di DNA e 2 ul di loading buffer mescolati con un puntale.
se il DNA è degradato non formerà una banda più o meno netta maosserverai una "smirata" lungo tutto il pozzetto di corsa. naturalmente avrai bisogno di un transilluminatore x una visione agli UV.
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oliveroreste
Nuovo Arrivato
14 Messaggi |
Inserito il - 13 ottobre 2011 : 15:21:38
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ho a diposizione un bioanalyzer. sapete se col chip del DNA posso provare la qualità? perchè mi hanno detto che se il DNA è frammentato non riesco a vedere nulla ma io ho letto le istruzioni del kit e dicono che invece si riesca a leggere anche il DNA frammentato.
qualcuno l'ha provato e sa dirmi?
graize |
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0barra1
Utente Senior
Città: Paris, VIIème arrondissement
3847 Messaggi |
Inserito il - 04 novembre 2011 : 16:20:14
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Interessa anche me questa domanda, qualcuno nel frattempo è giunto ad una risposta?
Up |
So, forget Jesus. The stars died so that you could be here today.
A Universe From Nothing, Lawrence Krauss
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 04 novembre 2011 : 17:04:04
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mmmm ma la domanda esattamente quale sarebbe?
Se puoi vedere il DNA degradato con il Bioanalyzer? |
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oliveroreste
Nuovo Arrivato
14 Messaggi |
Inserito il - 04 novembre 2011 : 18:26:12
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a dire il vero dovrei provare la qualità del DNA col chip e volevo sapere se qualcuno l'aveva già provato e sapeva dirmi se funziona e come si deve fare la valuatzione finale.
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 04 novembre 2011 : 18:41:20
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Personalmente non l'ho mai utilizzato, però sapevo che mentre per l'RNA si utilizza anche per vederne la qualità, per il DNA genomico non ho mai sentito che venisse utilizzato e non ho trovato neanche niente nel loro sito.
In realtà per i DNA-chip ti dice questo:
Citazione:
The DNA kits together with the Agilent 2100 Bioanalyzer, are ideal for automated sizing and quantification of PCR fragments, restriction digests or fragmented DNA.
quindi va bene in realtà per il DNA frammentato ma non per il genomico, in teoria vedresti bene il DNA degradato ma non quello integro. Poi non so che chip tu abbia di preciso, ma ci sono vari tagli in base alla grandezza dei frammenti ma tutti mi sembrano troppo piccoli per vedere del genomico.
Perché non fai un semplice gel di agarosio come ti è stato consigliato?
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oliveroreste
Nuovo Arrivato
14 Messaggi |
Inserito il - 04 novembre 2011 : 18:44:44
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eh che uno dei supervisor sostiene che questo metodo essendo un kit automatizzato sia più preciso e mi chiede i risultati con quello ma io non so poi come leggerlo.
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 04 novembre 2011 : 19:19:20
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Boh, sinceramente secondo me non si più fare.
Quello che dovresti vedere comunque (con qualunque metodo tu utilizzi) sono delle bande a peso molecolare molto elevato nel caso di DNA integro (su gel vedi un'unica grossa banda) mentre varie bande a peso più basso (tipicamente su gel uno smear) se è degradato.
Quindi con il Bioanlyzer forse potresti vedere qualcosa con il kit DNA 12000 Kit che ti permette di discriminare bande tra 100–12000 bp, il genomico integro dovrebbe comunque essere fuori scala.
Ho provato a cercare ma non si trova niente della visualizzazione del DNA genomico con il Bioanlyzer, se non frammenti di PCR o di restrizione.
A questo punto senti direttamente il supporto tecnico dell'Agilent così ti togli ogni dubbio.
Poi dì al tuo supervisor che il metodo per vedere la qualità del DNA è il gel. |
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oliveroreste
Nuovo Arrivato
14 Messaggi |
Inserito il - 05 novembre 2011 : 12:49:04
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grazie mille!
a questo punto farò una prova come dici tu e chiederò anche ad agilent poi se non va bene faccio vedere i risultati al supervisor e se negativi gli spiego per il gel!!
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oliveroreste
Nuovo Arrivato
14 Messaggi |
Inserito il - 10 novembre 2011 : 13:31:16
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ce l'ho fatta: il supervisor si è convinto a farmi fare un gel!
ho visto il sito per la preparazione del gel di agarosio ma mi rimane una domanda: qual'è la quantità di DNA da caricare.
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 10 novembre 2011 : 18:08:01
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Citazione:
Messaggio inserito da oliveroreste
ce l'ho fatta: il supervisor si è convinto a farmi fare un gel!
Bene!
Citazione:
Messaggio inserito da oliveroreste
ho visto il sito per la preparazione del gel di agarosio ma mi rimane una domanda: qual'è la quantità di DNA da caricare.
Tra i 100-500ng di DNA. |
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oliveroreste
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14 Messaggi |
Inserito il - 11 novembre 2011 : 12:01:03
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fatto ma mi risulta che la banda del DNA sembra dentro il pozzetto. ho letto che occorre aggiungere 1% SDS perchè il DNA potrebbe essere legato a proteine e quindi non esce dal pozzetto.
cosa ne pensi a riguardo? mi dicono di usare agarosio 0.6%. a che V devo farlo correre e per quanto tempo?
hai qualche info su questo?
grazie mille. |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 11 novembre 2011 : 17:22:40
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Beh se la banda è dentro il pozzetto è un bene, significa che il DNA non è degradato! 
In realtà in un gel di agarosio non riesci a far migrare bene il DNA genomico se è integro perché è molto grosso, quindi comunque ti rimarrà nel pozzetto o migrerà poco fuori.
Per farlo uscire dal pozzetto devi farlo migrare per molto tempo.
Dipende anche dal gel e dall'apparato che utilizzi, comunque io farei almeno 100V per 30min. In ogni caso puoi stoppare il gel, guardarlo sul transilluminatore e se non ti sembra migrato abbastanza rimetterlo ancora a migrare.
Il DNA se è estratto bene non dovrebbe essere legato a proteine, altrimenti sarebbe un'estrazione venuta male. Se vuoi però puoi anche seminare due pozzetti, uno con SDS e uno senza.
Io non ho mai messo SDS per far migrare del DNA. |
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oliveroreste
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14 Messaggi |
Inserito il - 11 novembre 2011 : 18:50:39
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in effetti estraggo DNA con protocollo trizol in seguito a estrazione RNA e ho letto che con questa tecnica spesso l'estrazione di DNA non viene bene e il DNA è degradato. quindi nel mio caso ci sono 2 ipotesi:
1. il DNA è molto grosso come dici tu e fatica a uscire dal pozzetto e suggeriscono di provare con gel a % più bassa di agarosio per cercare di farlo correre meglio
2. il DNA è legato a proteine e occorre usare SDS 1% per staccarlo.
proverò entrambi e speriamo di vedere qualcosa. poi ti dico.
grazie |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 11 novembre 2011 : 19:40:35
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Sì in effetti con Trizol potrebbe essere.
Io con Trizol ho estratto solo RNA e proteine, il DNA lo buttavo.
Comunque visto che tu estrai con questo metodo, se ti va potresti anche rispondere a questa discussione dove c'è un'utente che ha problemi con questa metodica?
http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=24654
magari poi vi potete anche confrontare.
Per quanto riguarda la percentuale del gel, puoi anche ridurla, ma non scenderei sotto 0,5% perché poi diventa molto fragile. Casomai fai migrare piano e allunga il tempo.
Comunque sia facci sapere come va la prossima prova! |
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oliveroreste
Nuovo Arrivato
14 Messaggi |
Inserito il - 16 novembre 2011 : 16:39:09
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fatto. vi dico un po' le mie considerazioni.
questa volta il DNA è sicuramente fuori dal pozzetto perchè si vede una banda nel pozzetto e una appena fuori. il DNA è un po' degradato ma con la metodica del trizol ci sta perchè ho parlato con un collega del lab che ha provato e dice che col fenolo il DNA tende a degradarsi (se qualcuno ha parere contrario sono sempre pronta a imparare!). l'unica cosa è che ho usato un ladder un po' piccolo per il DNA che mi risulta ma a me interessa vedere se la qualità può andare.
ora devo spedire tutto al lab che lo deve analizzare e spero che a loro vada bene. incrocio le dita!
per ora grazie. se avrò bisogno richiederò aiuto.
ogni consiglio/commento è ben accetto.
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qualità DNA
Didattica e Relazioni
