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 estrazione di DNA genomico da linee cell
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silvietta82
Utente Junior



126 Messaggi

Inserito il - 21 dicembre 2011 : 10:29:36  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di silvietta82 Invia a silvietta82 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao a tutti. Devo estrarre del DNA genomico da diverse linee cellulari per poi analizzare lo stato di meilazione di alcuni promotori mediante la tecnica di conversione con bisolfito. Non ho mai estratto DNA genomico da cellule in coltura...mi chiedevo se è opportuno utilizzare fenolo/cloroformio+proteinase K e se qualcuno ha qualche protocollo efficente! Grazie

_ARY_
Nuovo Arrivato

_ARY_

Prov.: mi
Città: milano


81 Messaggi

Inserito il - 21 dicembre 2011 : 19:49:07  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di _ARY_ Invia a _ARY_ un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ciao,
io ho estratto il DNA da batteri trasformati, ma non so se ti serve.

prima ho fatto ESTRAZIONE DEL DNA PLASMIDICO SU PICCOLA SCALA (MINIPREP):
Vanno precedentemente rilanciate le colonie: si prendono tanti tubi per batteri, quante sono le colonie in piastra. Utilizzando il puntale della micropipetta P200 vengono raccolte le colonie e le sono poste nel tubo contenente 2 mL di LB liquido e Kanamicina (1:1000), si lasciano i tubi a 37°C overnight in agitazione.
Si sottopongono a MINI tutte le colonie rilanciate il giorno prima, seguendo il metodo descritto dal Maniatis.

poi, ESTRAZIONE DEL DNA PLASMIDICO SU LARGA SCALA (MIDIPREPS CON KIT QUIAGEN):
Il DNA delle MINI viene amplificato in LB overnight a 37°C e purificato seguendo il protocollo Quiagen per preparazioni MIDI.

se ti serve tutta la procedura passo per passo te la scrivo.
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silvietta82
Utente Junior



126 Messaggi

Inserito il - 22 dicembre 2011 : 11:49:55  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di silvietta82 Invia a silvietta82 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
No, estraggo anch'io abitualmente il DNA plasmidico da batteri utilizzando i kit; solo che ora devo estrarre DNA GENOMICO da LINEE CELLULARI e non abbiamo soldi per comprare i kit...pensavo di farlo con fenolo-cloroformio e proteinase K, ma non ho protocolli, potrei procurarmeli su internet, ma volevo consultarmi con qualcuno di più esperto che abbia già provato qualche protocollo e che mi possa dare qualche indicazione per non farmi "andare alla cieca"....insomma se qualcuno ha già estratto DNA da linee cellulari mi piacerebbe sapere quale metodo ha applicato, da quante cellule è partito, in piastre di quale diametro ecc. ...e sopratutto se ha avuto una buona resa...Se qualcuno può aiutarmi dandomi qualche indicazione sulla fase di estrazione del DNA mi farebbe un grosso favore, alla fase successiva di trattamento con bisolfito ci penserò dopo, magari userò dei kit..
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


7894 Messaggi

Inserito il - 22 dicembre 2011 : 19:13:34  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
L'estrazione di DNA da cellule in coltura non è particolarmente difficile, è decisamente più semplice rispetto a quella da tessuto perché non devi disgregare il tessuto.

Se vuoi farlo utilizzando materiale che hai "in casa" (o meglio "in lab") puoi utilizzare qualsiasi protocollo per estrazione di DNA e adattarlo.
Io ad es. utilizzavo delle soluzioni per estrarre DNA da sangue (qua trovi il protocollo: http://www.molecularlab.it/protocolli/protocol.asp?id=73) e quando ho dovuto estrarre da cellule in coltura non ho fatto altro che adattare quello, in pratica partendo dal punto di lisi dei globuli bianchi.
Se ti interessa le modifiche del protocollo sono queste:
Citazione:
1. Aspirare il medium di coltura dalla flask (T75)
2. Lavare 2 volte con 10ml con PBS freddo
3. Rimuovere tutto il PBS
4. Aggiungere 1,5ml di PBS freddo, staccare le cellule dalla flask e trasferirle in una provetta da centrifuga
5. Centrifugare a 1000rpm per 10min. a 4°C
6. Risospendere il pellet in 5-10 volumi di PBS freddo e centrifugare di nuovo a 1000rpm per 10min. a 4°C
7. Eliminare il PBS e risospendere il pellet
8. Aggiungere 1 ml di WCL Solution per ogni 5x10^6 cellule
9. Incubare a 37°C per 60 min.
10. Aggiungere 0.52 ml di Protein Precipitation Solution per ogni ml di WCL Solution e vortexare vigorosamente per almeno 25sec.
11. Centrifugare a 13000 rpm per 10 min.
12. Recuperare il surnatante che contiene il DNA in una provetta
13. Aggiungere 2 vol. di Etanolo assoluto a RT, agitare per inversione fino alla formazione del gomitolo
14. Centrifugare a 3500 rpm per 5min per far precipitare il gomitolo
15. Eliminare l'etanolo assoluto e far asciugare la provetta
16. Aggiungere 3ml di etanolo 70% freddo
17. Centrifugare a 3500 rpm per 5min
18. Eliminare l'etanolo 70% e lasciar asciugare la provetta invertita su carta assorbente
19. Dissolvere il DNA in H2Odist. sterile da 50 a 300ul a seconda della grandezza del gomitolo
20. Incubare a 37°C in bagnetto in agitazione per circa 1h per far sciogliere il DNA oppure lasciar sciogliere a 4°C o.n.

le soluzioni le trovi nel protocollo.

Puoi anche utilizzare fenolo/cloroformio se hai quello, di protocolli ne trovi vari e dovrebbero essere abbastanza buoni, come dicevo all'inizio non è una cosa particolarmente difficile.


GFPina ^_^

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Loraia
Nuovo Arrivato



13 Messaggi

Inserito il - 15 maggio 2013 : 17:58:51  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Loraia Invia a Loraia un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao!
io dovrei estrarre DNA genomico da cellule di cancro al seno e nel mio lab mi hanno detto di provare col trizol ma non riesco ad avere del DNA decente....secondo te, GFPina, il protocollo che usi potrebbe andare bene anche nel mio caso?e mi potresti dire come e' composto la Protein Precipitation Solution? ho guardato nel link che hai postato ma mi dice "reagente non trovato"....scusa la mia ignoranza ma ho sempre lavorato con batteri dove tutto era mooooooooooolto più semplice (anche comunicare coi colleghi in italiano invece che inglese era molto più easy :P)
grazie mille!
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


7894 Messaggi

Inserito il - 15 maggio 2013 : 18:18:42  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Il protocollo è adattabile a tutte le cellule in coltura, non ho mai lavorato con cellule di cancro ma dovrebbe funzionare.

Il Trizol col DNA in effetti a volte da dei problemi, se non si sta molto attenti non è molto pulito.

Per la soluzione che manca è questa: http://www.molecularlab.it/protocolli/reagent.asp?name=Protein%20Precipitation%20Solution

appena ho tempo sistemo anche il protocollo (grazie della segnalazione!)

GFPina ^_^

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Loraia
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Inserito il - 15 maggio 2013 : 23:27:21  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Loraia Invia a Loraia un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
grazie mille!!!!!!!!!
altra domanda....più o meno quante cellule mi serviranno? 5x10^6? o anche meno sono sufficienti?
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Loraia
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13 Messaggi

Inserito il - 20 maggio 2013 : 11:02:16  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Loraia Invia a Loraia un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
sono di nuovo qui!scusate se rompo ma con moli e tutto il resto sono messa malissimo e nessuno qui mi aiuta :( come cavolo faccio a preparare le soluzioni?e posso prepararne uno stock da usare più avanti o le devo preparare al momento?grazie millissime!
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GFPina
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GFPina

Città: Milano


7894 Messaggi

Inserito il - 20 maggio 2013 : 14:34:04  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da Loraia

altra domanda....più o meno quante cellule mi serviranno? 5x10^6? o anche meno sono sufficienti?

Quante cellule ti servono dipende da quanto DNA vuoi.
Una cellula umana contiene circa 7pg di DNA, puoi farti i conti di quante te ne servono. Da 5x10^6 cellule, considerando un'efficienza del 100% (anche se non è tale in realtà) otterresti 35ug di DNA che non sono affatto pochi!
Per la maggior parte delle applicazioni ne servono molti meno!

Citazione:
Messaggio inserito da Loraia

sono di nuovo qui!scusate se rompo ma con moli e tutto il resto sono messa malissimo e nessuno qui mi aiuta :( come cavolo faccio a preparare le soluzioni?

Queste pagine che abbiamo scritto apposta ti possono essere utili:
http://www.molecularlab.it/principi/calcoli-laboratorio/


Citazione:
e posso prepararne uno stock da usare più avanti o le devo preparare al momento?

Si puoi benissimo preparare uno stock e conservarle diversi mesi!

GFPina ^_^

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Loraia
Nuovo Arrivato



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Inserito il - 21 maggio 2013 : 13:38:36  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Loraia Invia a Loraia un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
grazie mille!!!!!!!!!!!!oggi provo...vediamo come va!fingers crossed:)
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Loraia
Nuovo Arrivato



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Inserito il - 23 maggio 2013 : 11:23:30  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Loraia Invia a Loraia un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
funzionato tutto alla perfezione!!!!!!!!!grazie mille!!!!!!!
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GFPina
Moderatore

GFPina

Città: Milano


7894 Messaggi

Inserito il - 23 maggio 2013 : 19:05:25  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di GFPina  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di GFPina Invia a GFPina un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Bene!

GFPina ^_^

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Loraia
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13 Messaggi

Inserito il - 16 dicembre 2013 : 12:11:48  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Loraia Invia a Loraia un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ciao a tutti!
visto che siete stati utilissimi e il protocollo che ho usato per le linee cellulari ha funzionato brillantemente continuo a sfruttarvi
ora devo estrarre DNA genomico da ossa congelate...come posso modificare il protocollo usato per il sangue? generalmente per estrarre RNA con triazol trituriamo le ossa, ma cmq dei residui rimangono e non so se questi possono interferire con l'estrazione del DNA....

grazie mille
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