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Autore Discussione  

federica81
Nuovo Arrivato

Prov.: Modena
CittÓ: modena


9 Messaggi

Inserito il - 15 febbraio 2007 : 16:03:50  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di federica81 Invia a federica81 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ciao ragazzi, io ho un problema di efficienza di amplificazione dei primer. Lo slope delle curve di amplificazione (Ct verso log RNA) Ŕ intorno a 2,5 per il target (efficienza > 100%) e invece 3.3 per l'endogeno (efficienza perfetta del 100%). Secondo voi da che cosa pu˛ dipendere un valore cosý alto di efficcienza??
Qualcuno ha mai usato il software REST (Plaff) per poter validare il metodo di quantizzazione delta delta Ct in real time PCR quando le efficienze dei primer del target e dell'endogeno sono diverse? Nel caso di un efficienza maggiore del 100 % si pu˛ usare comunque questo software?
Grazie mille.

cin
Utente Junior

ptero

Prov.: Padova
CittÓ: Padova


558 Messaggi

Inserito il - 15 febbraio 2007 : 18:37:00  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di cin Invia a cin un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ne avevamo giÓ parlato qui:
http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=1400
dacci un occhio....
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barbapapÓ
Nuovo Arrivato



10 Messaggi

Inserito il - 16 febbraio 2007 : 12:36:51  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di barbapapÓ Invia a barbapapÓ un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da federica81

ciao ragazzi, io ho un problema di efficienza di amplificazione dei primer. Lo slope delle curve di amplificazione (Ct verso log RNA) Ŕ intorno a 2,5 per il target (efficienza > 100%) e invece 3.3 per l'endogeno (efficienza perfetta del 100%). Secondo voi da che cosa pu˛ dipendere un valore cosý alto di efficcienza??
Qualcuno ha mai usato il software REST (Plaff) per poter validare il metodo di quantizzazione delta delta Ct in real time PCR quando le efficienze dei primer del target e dell'endogeno sono diverse? Nel caso di un efficienza maggiore del 100 % si pu˛ usare comunque questo software?
Grazie mille.

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barbapapÓ
Nuovo Arrivato



10 Messaggi

Inserito il - 16 febbraio 2007 : 12:50:29  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di barbapapÓ Invia a barbapapÓ un Messaggio Privato  Rispondi Quotando

Dunque Federica,
innanzitutto permettimi di dirti che lo slope della retta standard (Ct verso log DNA) si esprime come valore negativo (quindi -3.3 o -2.5) e non come valore positivo...
Lo slope Ŕ correlato con l'efficienza di PCR secondo la seguente formula:

E = [10 exp (-1/slope)] - 1

Con un valore di slope di -2.5 hai quindi un'efficienza del 150%.

Generalmente l'efficienza Ŕ cosý alta quando gli standard a concentrazione pi¨ alta della curva standard sono affetti da inibizione.
Che succede se elimini dall'analisi gli standard a concentrazione pi¨ alta? Migliora l'efficienza?
Fammi sapere e se riesci mandami copia della curva standard (con il software Opticon Monitor dovresti riuscire ad esportare l'immagine della curva standard). prova a mandarmela.

ciao
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federica81
Nuovo Arrivato

Prov.: Modena
CittÓ: modena


9 Messaggi

Inserito il - 16 febbraio 2007 : 14:42:52  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di federica81 Invia a federica81 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Eliminando i valori a pi¨ alta concentrazione della curva l'efficienza migliore raggiunge valori meno positivi (tipo -2,8)...Questo effetto di inibizione della PCR pu˛ dipendere dalla qualitÓ del campione. Io estraggo RNA con Trizol e lo tratto con DNAse che dopo inattivo per via chimica. Quindi Ŕ probabile che mi porto dietro dei sali o delle proteine che danno problemi.
Inoltre volevo sapere se secondo te con questi parametri di efficienza Ŕ possibile usare il software REST per l'analisi delta delta Ct dei dati.
Se faccio una curva con fattori di diluizione 1:2, il valore di riferimento dell'efficienza rimane sempre -3.33??
Grazie mille. ciao
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barbapapÓ
Nuovo Arrivato



10 Messaggi

Inserito il - 16 febbraio 2007 : 15:14:12  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di barbapapÓ Invia a barbapapÓ un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Hai provato a verificare la qualitÓ del tuo RNA allo spettrofotometro (A260/A280) e/o su gel?
Non conosco il software REST ma ho trovato una pubblicazione del 2002 di Pfaffl, me la leggo e lunedý ti do la mia opinione.

L'efficienza di PCR (cioŔ lo slope della retta di taratura) non dipende dal tipo di diluizione che fai. L'efficienza Ŕ del 100% se lo slope Ŕ -3.3, sia che la tua retta tu l'abbia ottenuta con diluizioni 1:2 sia che tu l'abbia ottenuta con diluizioni 1:10.

Posso chiederti che strumento real time utilizzi?
Che tipo di standard utilizzi? e' DNA genomico oppure cDNA?
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federica81
Nuovo Arrivato

Prov.: Modena
CittÓ: modena


9 Messaggi

Inserito il - 16 febbraio 2007 : 15:26:24  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di federica81 Invia a federica81 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Allo spettrofotometro ho delle ratio che oscillano tra 1,8 e 2,2..comunque per risolvere il problema della qualitÓ pensavo di fare un clean up dell'RNA su colonna. Ti far˛ sapere se cambia qualcosa.
Utilizzo il 7900 Fast HT.
Lo standard che uso Ŕ GAPDH e lavoro con SYBR GREEN. Si tratta di cDNA.CIAO
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barbapapÓ
Nuovo Arrivato



10 Messaggi

Inserito il - 19 febbraio 2007 : 15:27:10  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di barbapapÓ Invia a barbapapÓ un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ho letto rapidamente l'articolo di Pfaffl sul software REST e sembrerebbe che il software esegue una correzione automatica se le efficienze di target e riferimento sono diverse.
Ma senti altre opinioni, io non l'ho mai utilizzato!!

Volevo chiederti: l'amplificazione del tuo gene target Ŕ specifica? CioŔ, cosa ottieni se, dopo PCR, fai una curva di melting? ottieni 1 o pi¨ picchi? Forse l'efficienza Ŕ cosý alta per un'amplificazione aspecifica del tuo target. L'hai messo a punto tu il saggio? E poi perchŔ utilizzi il Sybr green invece delle sonde?

Ti faccio un sacco di domande, magari inopportune, ma voglio cercare di capire il tuo problema!

ciao
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283
Nuovo Arrivato



115 Messaggi

Inserito il - 04 luglio 2012 : 23:16:21  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di 283 Invia a 283 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
[quote]Messaggio inserito da barbapapÓ


Dunque Federica,
innanzitutto permettimi di dirti che lo slope della retta standard (Ct verso log DNA) si esprime come valore negativo (quindi -3.3 o -2.5) e non come valore positivo...
Lo slope Ŕ correlato con l'efficienza di PCR secondo la seguente formula:

E = [10 exp (-1/slope)] - 1

Ciao a tutti! mi inserisco in questa discussione un p˛ vecchia..
volevo chiedere se mi sapete sire perchŔ usate questa formula per calcolare l'efficienza..ovvero nelle formule che conosco e che ho trovato da pfaffl e=[10 exp (-1/slope)]..senza - 1 e quindi non capisco perchŔ nelle vostre formule sia cosý.grazie per la risposta
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picchiasebino
Nuovo Arrivato


CittÓ: roma


52 Messaggi

Inserito il - 05 luglio 2012 : 18:34:52  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di picchiasebino Invia a picchiasebino un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ciao Federica 81,
se la curva di diluizione dell'endogeno Ŕ perfetta, escluderei problemi di qualitÓ di RNA (anche se Ŕ un target rappresentato al 100%). Tenderei a pensare che il problema sia nella concentrazione dei primer. Usi un protocollo validato? Io proveri a raddoppiare la concentrazione dei primer....
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0barra1
Utente Senior

Monkey's facepalm

CittÓ: Paris, VIIŔme arrondissement


3847 Messaggi

Inserito il - 05 luglio 2012 : 18:39:21  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di 0barra1 Invia a 0barra1 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ChissÓ se Federica dopo 5,5 anni ha risolto il suo problema...

So, forget Jesus. The stars died so that you could be here today.
A Universe From Nothing, Lawrence Krauss

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picchiasebino
Nuovo Arrivato


CittÓ: roma


52 Messaggi

Inserito il - 06 luglio 2012 : 19:17:22  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di picchiasebino Invia a picchiasebino un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
Messaggio inserito da 0barra1

ChissÓ se Federica dopo 5,5 anni ha risolto il suo problema...



ahahahaha, e chi se ne Ŕ accorto.... Federica dove sei????
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