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Tag   Nanodrop    curva standard    quantificazione RNA    RNA  Aggiungi Tag

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randomcoil
Nuovo Arrivato



8 Messaggi

Inserito il - 29 luglio 2014 : 23:04:35  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di randomcoil Invia a randomcoil un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Salve a tutti! Oggi ho quantificato dei campioni di RNA con il nanodrop per la prima volta, e mi chiedevo una cosa: come fa lo strumento a determinare la concentrazione pur non avendo una curva standard specifica per quella quantificazione? Cioè, vero è che imposto un programma specifico per l'acido nucleico che voglio quantificare, ma tra un'estrazione e un'altra diversa, cambiando per esempio il buffer, la correlazione tra assorbanza e concentrazione varia no? Oppure questa variazione è tanto piccola da consentire di avere una buona accuratezza anche usando una curva standard preimpostata e memorizzata nello strumento?
Chiedo scusa per la banalità della domanda, sono davvero alle prime armi :)

domi84
Moderatore

Smile3D

Città: Glasgow


1724 Messaggi

Inserito il - 02 agosto 2014 : 12:51:33  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di domi84 Invia a domi84 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Il DNA ha un picco di assorbimento a 260 nm



La quantità di luce assorbita è direttamente proporzionale alla quantità di DNA presente.
Conoscendo la lunghezza percorsa dalla luce (1mm nel nanodrop),

il coefficiente di assorbimento (50 per il dsDNA) e la quantità di luce assorbita si può ricavare la concentrazione.

Consiglio vivamente di usare lo spettrofotometro per familiarizzare meglio con questo concetto:
http://www.molecularlab.it/relazioni/dna_ricombinante/01_concentrazione_dna_tramite_spettrometria.asp

e la lettura:
http://it.wikipedia.org/wiki/Legge_di_Lambert-Beer

EDIT:
Citazione:

cambiando per esempio il buffer, la correlazione tra assorbanza e concentrazione varia no?


infatti. bisogna anche leggere il buffer in cui è il DNA e sottrarlo.

Il mio blog: http://domi84.blogspot.com/
Le foto che ho scattato...
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