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-1° Giorno-
Determinazione della concentrazione di DNA in soluzione attraverso metodi spettrofotometrici

Protocollo:
Si determinerà la concentrazione di una soluzione di DNA relativo al vettore di clonaggio pGEM7zf, precedentemente purificato in grande quantità. Si userà sia la spettrofotometria begli ultravioletti (UV) che la valutazione effettuata dopo elettroforesi in gel d'agarosio.

Impostare lo spettrofotometro sulla lunghezza d'onda di 260 nm.

  • In una cuvetta di quarzo porre 1ml di acqua (bianco) e azzerare lo strumento.
  • Preparare una cuvetta di quarzo contenente 698ul di H20 e qaggiungere 2ul della soluzione di DNA plasmidico (diluizione 1:350).
  • Coprire con parafilm e miscelare capovolgendo delicatamente la cuvetta.
  • Introdurre la cuvetta nello spettrofotometro e leggere l'assorbanza (A) a 260 nm.
  • Tornare sul bianco spostare la lunghezza d'onda a 280nm. Azzerare lo strumento.
  • Passare al campio e leggere l'A280.
  • Coi risultati ottenuti, calcolare la concentrazione di DNA sapendo che in una cuvetta con un cammino di 1 cm, il DNA a doppio filamento alla concentrazione di 50ug/ml ha un assorbimento di 1 a 260nm:

    Concentrazione DNA /ug/ml)=A260nm x 50ug/ml
    1 Unità assorbimento

  • Per risalire alla concentrazione iniziale della soluzione moltiplicare il valore ottenuto per il fattore di diluizione (x350)
  • Calcolare il rapporto delle letture a 260nm e 280nm. Tale rapporto dovrebbe essere >= 1.7 per una preparazione pura di DNA. Se il rapporto è < di 1.7 significa che è presente una contaminazione da parte delle proteine.
  • Partendo dal valore calcolato, preparare una soluzione di 10ul di DNA plasmidico alla concentrazione di 150 ng/ul diluendo con tampone TE [Tris HCl 10mM, EDTA 1mM pH8]

Note, risultati e conclusioni:
L'entità dell'assorbimento varia in funzione della natura del DNA, infatti DNA denaturato assorbe di più.
In particolare l'assorbanza (A) è in proporzione alla concentrazione, come descritto dalla legge di Lambert-Beer (che è valida solo per luce monocromatica).

A260nm A280nm
0.092 0.057

Con coefficiente di purezza = A260/A280 = 1.614
Dove se questo valore è maggiore o uguale a 1.7 si a una preparazione pura di DNA, altrimenti è presente una contaminazione proteica.


 
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