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Inserito il - 12 maggio 2007 : 21:08:23  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di n/a Invia a n/a un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Cortesemente potreste indirarmi come ricavare i dati da una retta di taratura (det. proteine con bradford) se ho diluito il campione incognito, visto che tq mi mandava fuori range.
inoltre, costruendo la retta, ho "sbagliato" la prima lettura di abs (il bianco) e un altro punto. Posso eliminarli e fare senza?
Grazie a tutti
Giorgia

Schuldiner86
Utente Junior

Biotech

Prov.: Viterbo
Città: Bologna


581 Messaggi

Inserito il - 13 maggio 2007 : 01:06:22  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Schuldiner86  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Schuldiner86  Invia a Schuldiner86 un messaggio Yahoo! Invia a Schuldiner86 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Allora, se tu hai la retta di taratura con sull'asse delle y i valori dell'assorbanza e sull'asse delle x i valori delle concentrazioni, puoi determinare la concentrazione in proteine del tuo campione o col metodo grafico, individuando il valore di concentrazione che corrisponde alla tua assorbanza con una retta parallela all'asse delle y che interseca l'asse delle x, oppure usi l'equazione della retta generica y=mx+c dove y sarà la tua assorbanza, x la tua concentrazione. Te la ricavi con l'equazione di una retta passante per 2 punti (x2-x1)(y-y1)-(y2-y1)(x-x1)=0 sostituendo alle x e alle y i valori di concentrazione e assorbanza della tua retta di taratura. Una volta ricavata, per determinare la concentrazione del tuo campione espliciti la x=(y-c)/m, dove y è la lettura dell'assorbanza del tuo campione e c e m sono i valori che ti sei ricavata prima. Devi poi moltiplicare il valore che ottieni per 1/diluizione (se hai diluito 1:100 moltiplichi per 10^2=100). Spero che qualcosa avrai capito... :P

Per il resto, fare la lettura del bianco è importante per tarare lo strumento, perché poi lo spettrofotometro ti andrà a sottrarre quel valore (che dovrebbe essere del bradford non legato), a quello delle letture...Quindi non so, ma penso che se il bianco è sbagliato la cosa possa influire.
Per il punto sbagliato, a rigor di logica, se la tua assorbanza del campione cade nel segmento di retta tra due punti giusti, allora quel punto lo puoi anche trascurare. Ma se nel segmento in cui cade l'assorbanza c'è quel punto sbagliato e uno giusto penso che non vada bene la cosa.



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chick80
Moderatore

DNA

Città: Edinburgh


11491 Messaggi

Inserito il - 13 maggio 2007 : 01:15:49  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Non capisco bene.... hai sbagliato a leggere il bianco o il primo punto della retta di taratura? Sono due cose diverse: il bianco è solo acqua e ti serve per tarare lo strumento. Il primo punto della retta di taratura avrà una concentrazione molto bassa di BSA (o di quello che hai usato x la retta di taratura)

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10 Messaggi

Inserito il - 13 maggio 2007 : 09:44:49  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di n/a Invia a n/a un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Intanto buongiorno e grazie!!! sorry ma nn sn molto pratica...
Allora io devo aver sbagliato qualcosa...perchè il bianco è venuto un valore molto più alto del 1° punto con lisozima (tarato con lisozima e nn BSA)...mi è uscita un'assorbanza di 1.5 circa...quando il primo punto è 0.75 circa.

purtroppo ilproblema è che dovrò fare una relazione e saper spiegare tutto il procedimento e quello che è successo...

e io cosa scrivo?
Confuso


Grazie davvero molto gentile,
Giorgia














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Schuldiner86
Utente Junior

Biotech

Prov.: Viterbo
Città: Bologna


581 Messaggi

Inserito il - 13 maggio 2007 : 10:28:58  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Schuldiner86  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Schuldiner86  Invia a Schuldiner86 un messaggio Yahoo! Invia a Schuldiner86 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Non so se ho capito bene, ma misà che allora lo strumento non l'hai tarato col bianco se il primo punto ti viene più alto...Anzi, se mi ricordo bene, il bianco ti dovrebbe dare un valore negativo alla lettura, però di questo non sono sicuro...



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chick80
Moderatore

DNA

Città: Edinburgh


11491 Messaggi

Inserito il - 13 maggio 2007 : 14:31:59  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Allora, in teoria la cosa funziona così:

Metti il bianco (che è solo acqua) nella cuvetta e tari lo spettrofotometro. La calibrazione serve perchè anche l'acqua di suo potrà assorbire della luce, quindi lo spettrofotometro considera quella quantità come 0. Se a questo punto rileggi il campione con l'acqua ti dovrebbe dare come valore ancora 0 (o un valore nei dintorni di 0, a seconda di quanto è buono lo strumento). Da quanto dici probabilmente non hai azzerato lo spettrofotometro con il bianco, altrimenti ti dovrebbe aver dato 0 solo con acqua....

Forse la cosa più giusta da fare a questo punto sarebbe ignorare il bianco e fare la retta di taratura con i valori ottenuti, perchè comunque anche gli altri campioni sono stati misurati con lo strumento non tarato correttamente.

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Schuldiner86
Utente Junior

Biotech

Prov.: Viterbo
Città: Bologna


581 Messaggi

Inserito il - 13 maggio 2007 : 15:04:31  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Schuldiner86  Clicca per vedere l'indirizzo MSN di Schuldiner86  Invia a Schuldiner86 un messaggio Yahoo! Invia a Schuldiner86 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Noi il bianco lo facevamo con acqua e Bradford e ci dava un valore negativo, ma non di tanto mi sembra. Comunque se tutti i valori sono stati letti senza taratura in teoria tutti hanno lo stesso errore, quindi ha ragione chick80.



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n/a
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10 Messaggi

Inserito il - 13 maggio 2007 : 17:38:11  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di n/a Invia a n/a un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Grazie davvero ragazzi!
molto molto gentili...ho paura che sia proprio come avete detto voi! non ho tarato lo strumento con il bianco!che pasticciona!

a presto
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chick80
Moderatore

DNA

Città: Edinburgh


11491 Messaggi

Inserito il - 13 maggio 2007 : 22:26:41  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Vabbè dai, è solo sbagliando che si impara! Ora ti ricorderai sempre di tararlo!

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Gst
Utente Junior


Prov.: Roma
Città: Ariccia


143 Messaggi

Inserito il - 14 maggio 2007 : 21:50:14  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Gst Invia a Gst un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Piccola precisazione...ininfluente ai fini del problema.....Ma in ogni caso il bianco si fa con acqua e Bradford....e dà 0...non un numero negativo! per il resto sono d'accordo con quanto già scritto

Ascoltami con gli occhi...
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chick80
Moderatore

DNA

Città: Edinburgh


11491 Messaggi

Inserito il - 14 maggio 2007 : 22:33:14  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Sì, certo, ci metti anche il Bradford, hai fatto bene a specificare.

Quando tari il bianco ti viene 0 ovviamente, ma a volte rileggendolo il bianco ti può venire tipo -0.001 o qualcosa del genere, ma quello dipende da fattori che difficilmente riuscirai a controllare, anche cose tipo lievi modifiche della posizione della cuvetta nello strumento.

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ChEyEnNe
Nuovo Arrivato



16 Messaggi

Inserito il - 08 ottobre 2007 : 18:09:39  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di ChEyEnNe Invia a ChEyEnNe un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
ragazzi è possibile spiegare con dei dati inventati, la retta di equazione?

valori del bianco:
1)0.000


valori in assorbanza:
1)0.166
2)0.139
3)0.154
4)0.152

valore del bianco per conferma dopo la lettura di tutti i composti:
1)0.000

grazie in anticipo
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chick80
Moderatore

DNA

Città: Edinburgh


11491 Messaggi

Inserito il - 08 ottobre 2007 : 22:17:29  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Eh... dovresti inventare dei valori un po' migliori... quelli non sembrano venire da una retta di taratura...
Comunque c'è una spiegazione qui:
http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=1378

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ChEyEnNe
Nuovo Arrivato



16 Messaggi

Inserito il - 09 ottobre 2007 : 13:40:57  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di ChEyEnNe Invia a ChEyEnNe un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
mmm forse sto sbagliando io....
Sto portando avanti un western blot e controllo le mie proteine sulla retta della BSA. Il mio controllo è a livello grafico ossia, nel manualino del protey assay esiste un grafico con la retta di regressione della BSA e della IGG (inserisco il mio valore in assorbanza sull'asse y e ricavo il valore in µg nell'asse x). Per similitudine con la mia proteina usa la BSA.
Come puoi vedere dai valori riportati sopra, quelli sono i veri dati da me ottenuti nella lettura in assorbanza delle mie proteine. Se io costruisco la retta di regressione su quei valori, ho notato che comunque i valori non corrispondono con quelli che mi ritrovo in modo grafico.
Forse mi servirebbe la retta di regressione della BSA?
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chick80
Moderatore

DNA

Città: Edinburgh


11491 Messaggi

Inserito il - 10 ottobre 2007 : 00:16:44  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Ah ok, non avevo ben capito il problema.
La retta di taratura la devi fare con BSA (o anche altre proteine vanno bene, basta averne una soluzione pura). Conviene fare la retta di taratura ogni volta che leggi le tue proteine, non ti fidare di usare sempre la stessa.

Per fare la retta prendi della BSA e fai delle soluzioni a concentrazione nota che leggi allo spettrofotometro. Poi costruisci la retta di regressione da quelle letture e ottieni qualcosa tipo A = 0.8 * C + 0.001 (numeri inventati a caso), da cui ricavi che C = (A-0.001)/0.8. A questo punto sapendo l'assorbanza (A) del tuo campione puoi trovarne la concentrazione (C).

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Notte



1123 Messaggi

Inserito il - 10 novembre 2008 : 12:29:53  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di n/a Invia a n/a un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Salve ragazzi sono nuova e scusate se tiro su questo post ma mi serve proprio questa cosa...

Sulle x ho le concentrazioni note di BSA e sulla y le loro relative assorbanze..
Da qui mi devo calcolare una retta di taratura (non riesco a trovare la funzione che fa questa cosa su openoffice math!!!Mi va bene anche trovarla solo graficamente e non calcolarla esattamente....La nuvola di punti giace quasi perfettamente su una retta, anche se qualche errorino sperimentale ovviamente c'è)

Dopo aver costruito questa retta, trovo altre tre concentrazioni incognite di BSA dopo aver trovato ovviamente la loro assorbanza...(anche solo ad occhio...Mi serve solo per confrontarle con un altro metodo precedente)

Ecco, in parole povere mi serve la funzione (sperando che openoffice lo faccia!) che data una nuvola di punti che converge in una retta, tracci la retta che minimizza l'errore..
(So che è una cazzata ma davvero non la trovo )
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Ayla
Utente Junior

guardiano

Città: Wageningen


573 Messaggi

Inserito il - 10 novembre 2008 : 13:09:13  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Ayla Invia a Ayla un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
so che excel la fa... ma openoffice non lo conosco...
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chick80
Moderatore

DNA

Città: Edinburgh


11491 Messaggi

Inserito il - 10 novembre 2008 : 13:17:25  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di chick80 Invia a chick80 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
La cosa più veloce è:

1) metti in grafico i punti
2) doppio click sul grafico per modificarlo.
3) selezioni i punti sul grafico (non l'area del grafico, proprio i punti, o la curva, a seconda di che grafico fai)
4) tasto dx: scegli "add trendline". Non so come sia in italiano... aggiungi linea di tendenza o qualcosa così
5) nella finestra che si apre puoi scegliere il tipo di regressione e se mostrare equazione e R2.

PS: credo funzioni solo con OpenOffice 3

In alternativa, con R:


> x = c(1,2,3,4)
> y = c(2.05, 4.01, 5.9, 8)
> glm(y~x)

Call:  glm(formula = y ~ x) 

Coefficients:
(Intercept)            x  
      0.055        1.974  

Degrees of Freedom: 3 Total (i.e. Null);  2 Residual
Null Deviance:	    19.49 
Residual Deviance: 0.00882 	AIC: -7.117 


Quindi in questo esempio la retta è y=1.974 x + 0.055

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domi84
Moderatore

Smile3D

Città: Glasgow


1723 Messaggi

Inserito il - 13 novembre 2008 : 15:24:26  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di domi84 Invia a domi84 un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Citazione:
La cosa più veloce è:

1) metti in grafico i punti
2) doppio click sul grafico per modificarlo.
3) selezioni i punti sul grafico (non l'area del grafico, proprio i punti, o la curva, a seconda di che grafico fai)
4) tasto dx: scegli "add trendline". Non so come sia in italiano... aggiungi linea di tendenza o qualcosa così
5) nella finestra che si apre puoi scegliere il tipo di regressione e se mostrare equazione e R2.

PS: credo funzioni solo con OpenOffice 3


A proposito...
sai come si può fare per dire ad OpenOffice di far passare la linea di tendenza per lo 0? (cioè per l'origine degli assi...)

Il mio blog: http://domi84.blogspot.com/
Le foto che ho scattato...
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