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isabella
Nuovo Arrivato
Città: bologna
19 Messaggi |
 Inserito il - 14 giugno 2007 : 16:48:00
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chi mi spiega come si fanno le mappe di restrizione???sto impazzendo e a giorni avrei un esame ...grazieeeeeeee
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
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isabella
Nuovo Arrivato
Città: bologna
19 Messaggi |
 Inserito il - 27 giugno 2007 : 16:47:26
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non ho capito il procedimento...sono in crisi! |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 27 giugno 2007 : 21:57:58
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Ok, don't panic!!!! :)
Innanzitutto devi ricordare che:
1) il numero di frammenti generato da un enzima è uguale al numero di siti di taglio + 1.
Quindi 1 sito di taglio = 2 frammenti, 2 siti = 3 frammenti e così via
2) la somma della lunghezza dei frammenti è = alla lunghezza totale del DNA
3) per mappare 2 o più enzimi di restrizione NON ti bastano le singole digestioni ma ti ci vogliono una o più doppie (o triple) digestioni.
Detto questo, facciamo un esempio
Digerisci un frammento di DNA con EcoRI e BamHI e ottieni
EcoRI => 520 bp + 1000 bp
BamHI => 200 bp + 300 bp + 1020 bp
EcoRI + BamHI => 200 bp + 220 bp + 300 bp + 800 bp
Allora, innanzitutto puoi vedere come in ciascuna reazione la somma dei frammenti sia sempre la stessa (1520bp). Perfetto.
Ora, cominciamo da EcoRI: ci dà 2 frammenti, quindi 1 sito di taglio. Cominciamo a scriverlo:
----------------E---------
1000 520
In questo caso non cambia nulla mettere prima il 1000 o prima il 520, semplicemente avremo la mappa scritta da un lato o dall'altro alla fine, ma le due situazioni sono equivalenti.
Passiamo a BamHI: ci dà 3 frammenti, quindi 2 siti di taglio. In questo caso però abbiamo varie possib ilità:
-----B-----B------------
200 300 1020
-----B------------B-----
200 1020 300
-------------B----B------
1020 200 300
Ancora una volta, le altre possibilità sono equivalenti, solo scritte nel senso inverso (es. 1020-300-200 è l'inverso della prima).
Benissimo ora dobbiamo semplicemente unire le due situazioni guardando la doppia digestione!
La cosa che io faccio di solito è:
1) guardare se nella doppia digestione ci sono frammenti uguali alla singola digestione. Questi frammenti saranno alle estremità (quindi non avranno altri siti di taglio al loro interno)
2) cercare frammenti nella doppia la cui somma sia uguali a frammenti nelle singole digestioni
Tornando al nostro esempio:
Nella doppia c'è un frammento da 200bp che c'è anche nella singola di BamHI.
Possiamo quindi ipotizzare che questo sia ad un'estremità.
Consideriamo dunque queste situazioni per BamHI (hanno 200 ad un'estremità):
-----B-----B------------
200 300 1020
-----B------------B-----
200 1020 300
Anche il frammento da 300 rimane nella doppia digestione, quindi probabilmente la mappa giusta sarà la seconda. A conferma di ciò vedi che gli altri 2 frammenti (800 e 220) danno come somma 1020!
Proviamo a testare questa ipotesi
Se queste sono le mappe singole che consideriamo
----------------E-------
1000 520
-----B------------B-----
200 1020 300
le possiamo "sommare" ed ottenere
-----B---------E--B-----
200 800 220 300
Et voilà! La mappa è pronta. |
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Nirvangirl
Nuovo Arrivato
Prov.: NA
80 Messaggi |
Inserito il - 27 maggio 2010 : 19:22:05
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Riapro un vecchio caso 
chick80 è molto chiara la tua spiegazione però ti vorrei chiedere dei piccoli chiarimenti.
Quando dici di vedere che in ciascuna reazione la somma dei frammenti è sempre la stessa (in qsto caso è 1520bp)deve essere sempre così o ci sono delle eccezioni?
Poi quando dici a)guardare se nella doppia digestione ci sono frammenti uguali alla singola digestione
intedi che dobbiamo guadare la doppia digestione
EcoRI + BamHI => 200 bp + 220 bp + 300 bp + 800 bp
con la singola di BamHI => 200 bp + 300 bp + 1020 bp
giusto?
Poi quando abbiamo la mappa pronta
-----B---------E--B-----
200 800 220 300
Se scrivessimo:
-----B--E---------B-----
200 220 800 300
sarebbe diverso?e se si,come facciamo a capire che abbiamo sbagliato?
Grazie
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Parauallr
Nuovo Arrivato
Città: Nocera Inf. (SA) - Roma
92 Messaggi |
Inserito il - 27 maggio 2010 : 20:19:50
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Ciao se è permesso rispondo io alle domande :D
Innanzitutto, la somma dei segmenti deve necessariamente essere uguale. Se digerisci la stessa sequenza con enzimi diversi il numero di basi non può cambiare :)
Per quanto riguarda la seconda domanda, nel nostro caso è proprio così, perchè per caso c'è coincidenza tra la doppia digestione e quella di BamHI. Ma il confronto va fatto con tutte le singole digestioni (in linea di massima comunque, devi ricercare i frammenti coincidenti tra quelli con il minor numero di basi tra quelli delle singole digestioni).
Sull'ultimo punto, la risposta è si, la situazione cambierebbe. Se ci fai caso, nella mappa che hai postato tu, la dgestione con EcoRI avrebbe prodotto due segmenti di 420 e 1100, anzichè 520 e 1000.
Spero di esser stato chiaro :)
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Nirvangirl
Nuovo Arrivato
Prov.: NA
80 Messaggi |
Inserito il - 28 maggio 2010 : 12:38:06
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Si grazie x la risposta.
Sei stato chiarissimo.Per l'ultima domanda ci avevo pensato anche io ma credevo che ci fosse una spiegazione più scientifica e credevo che la mia nn andasse bene,invece è proprio così XD
Ti vorrei chiedere un'altra cosa per avere una tripla digestione dovrei avere 3 enzimi (che fanno una digestione singola ognuno) e poi diciamo la loro combinazione contemporaneamente (ovvero la tripla digestione) giusto? |
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Parauallr
Nuovo Arrivato
Città: Nocera Inf. (SA) - Roma
92 Messaggi |
Inserito il - 28 maggio 2010 : 12:47:39
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Beh di digestioni puoi farne triple, quadruple, decuple o milluple (??), così da creare mappe sempre più precise. In una sequenza, più sono gli enzimi utilizzati, più sono i siti di restrizione riconosciuti :)
Naturalmente, per poi poter eseguire la costruzione della mappa (che diventa cmq più difficile con più enzimi), è ovvio che bisogna effettuare anche la digestione generale con tutti gli enzimi. |
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Nirvangirl
Nuovo Arrivato
Prov.: NA
80 Messaggi |
Inserito il - 28 maggio 2010 : 13:29:25
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Ok Grazie.
Percaso conosci la differenza tra le RSP (polimorfismo di siti di restrizione) e il RFLP (polimorfismo da lunghezza dei frammenti di siti di restrizione)?
Io so solo che i Rsp generano Rflp mi sai dire qualche altra cosa?
O cmq qualcun altro le conosce?
Grazie |
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Parauallr
Nuovo Arrivato
Città: Nocera Inf. (SA) - Roma
92 Messaggi |
Inserito il - 28 maggio 2010 : 13:55:13
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RSP e RFLP sono praticamente la stessa cosa, ma espressi in due concetti diversi.
RSP si riferisce ai polimorfismi in cui siti di restrizione sono diversi. RFLP si riferisce al fatto che, in polimorfismi in cui siti di restrizione sono diversi, si producono frammenti di restrizione di lunghezza diversa (perchè i siti di restrizione , se sono mutati, non vengono riconosciuti).
Quindi come dicevi, i RSP (diversità nei siti di restrizione) generano RFLP (iversità di lunghezza dei frammenti).
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Nirvangirl
Nuovo Arrivato
Prov.: NA
80 Messaggi |
Inserito il - 28 maggio 2010 : 17:07:44
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| Grazie mille ciaooo |
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mappe di restrizione
