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atreliu
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Inserito il - 12 novembre 2003 : 06:20:41
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Ciao Federico.
Sul sito sono presenti due relazioni. La prima sull'Isolamento del dna cromosomale da lievito.
La seconda, sempre sull'estrazione di DNA, ma questa volta plasmidico: Estrazione plasmidica dai cloni ricombinanti.
In rete ho trovato questo, segnalato come metodo classico (ovvero senza l'uso di kit) per l'estrazione di dna genomico da cellule del sangue, appunto:
Il protocollo seguito per estrarre il DNA leucocitario prevede l'impiego di sangue trattato con un anticoagulante (citrato di sodio 0,127M; EDTA 50mM). A 3ml di sangue si aggiungono 9ml di tampone di lisi (NH4Cl 155mM, KHCO3 10mM, EDTA 0,1mM). Dopo aver miscelato si effettua un'incubazione di 20' in ghiaccio, quindi si centrifuga a 1500 rpm per 10' e si scarta il supernatante. In caso si formi un precipitato troppo compatto, si aggiunge nuovamente la soluzione di lisi e si ripete l'operazione descritta. Il precipitato, contenente il DNA ed altre contaminanti per lo più di origine proteica, viene lavato 2-3 volte con acqua bidistillata, fino ad ottenere una soluzione sufficientemente limpida, libera dall'EME.
Si aggiungono 900ml di soluzione SE (NaCl 75mM, EDTA 25mM), 90ml di SDS al 10%, per rompere i ponti disolfuro delle proteine e 20ml di enzima pronase 10mg/ml, questa ha un'azione proteolitica che serve a liberare il DNA dalle proteine ad esso associate; infine si risospende il precipitato e lo si lascia per una notte a 37°C, per consentire alle proteasi di agire.
Il giorno successivo vengono aggiunti 300ml di una soluzione satura di NaCl (6M), si mescola col vortex per circa 15", quindi si centrifuga a 2500 rpm per 15' a 4°C. Si procede aggiungendo un uguale volume di cloroformio, e si centrifuga a 4500 rpm per 5 minuti. In questo modo la componente proteica precipita, l'eme si localizza all'interfaccia in un visibile anello di colore bruno, mentre il DNA rimane in sospensione nella fase acquosa.
L'operazione successiva consiste nel recupero della fase acquosa superiore, a cui si aggiungono due volumi di etanolo assoluto, e si mescola delicatamente fino ad individuare il DNA, condensato sotto forma di un precipitato filamentoso, detto "medusa". Questo viene "pescato" con una pasteur chiusa e ripiegata ad uncino, lasciato asciugare all'aria e lavato in etanolo al 70% per ripulirlo ulteriormente e per consentire una solubilizzazione più agevole. La "medusa" viene risospesa in 300ml di acqua bidistillata mediante prolungata rotazione della provetta a 4°C.
La resa dell'estrazione viene stimata attraverso lo spettrofotometro, leggendo i valori di assorbanza a 260 nm, e assumendo che a tale lunghezza d'onda una soluzione di DNA 40mg/ml abbia un'assorbanza di 1OD. Per stimare la qualità del DNA estratto si valuta il rapporto tra l'assorbanza a 260 nm (DNA) e quella a 280nm (proteine). La soluzione ottenuta viene opportunamente diluita e suddivisa in diverse aliquote da conservata a -20°C fino al loro utilizzo.
Spero di esserti stato di aiuto,
Riky
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