-11° giorno-
Isolamento di DNA cromosomale da lievito
Procedimento:
Estrazione del cromosoma circolare di lievito (S. cerevisiae )in
un ceppo geneticamente modificato.
Note, risultati e conclusioni:
Con questa esperienza vogliamo sperimentare l'estrazione di DNA
cromosomale e analizzare la mutazione genetica introdotta nel mutante.
Per l'estrazione cromosomale, abbiamo utilizzato un primo tampone
contenente: SORBITOLO (per creare ambiente ipertonico), EDTA (che
sequestra gli ioni presenti, evitando l'utilizzo di questi da parte
della Dnasi), ß-MERCAPTOETANOLO, ZIMOLIASI (enzima che idrolizza
la parete cellulare, causando così la formazione di sferoplasti
| |
MUTANTE |
WILDE TYPE |
| OD450 |
0,901 (T=0) |
0,936 (T=20') |
| OD450 |
0,388 (T=0) |
0,354 (T=20') |
Effettuiamo due misure spettrofotometriche, per osservare
il cambiamento di assorbanza dovuto all'azione del tampone.
Il tampone successivo, per la presenza di SDS, serve
per rompere gli sferoplasti .
L'innalzamento successivo della temperatura, causa la denaturazione
delle proteine, che grazie all'aggiunta di acetato di potassio,
precipitano.
Una volta prelevato il surnatante, l'isopropanolo permette la precipitazione
del DNA; mentre l'aggiunta di un terzo tampone contenente Rnasi,
permette di idrolizzare l'RNA.
Effettuiamo una elettroforesi dell'estrazione
cromosomica.
Microbiologia
