Quanto è utile/interessante questa discussione:
| Autore |
Discussione |
|
|
marina1983
Nuovo Arrivato
18 Messaggi |
 Inserito il - 15 febbraio 2008 : 21:07:10
|
ciao a tutti!
sto facendo una PCR utilizzando 2 coppie di primer. nella prima coppia i primer hanno una temperatura di melting di 60, nella seconda di 60 e 58.
le 2 coppie amplificano dei frammenti molto grandi, 1500 e 1200 paia di basi rispettivamente.
lo so che i frammenti sono molto grandi, ma purtroppo devo provarci lo stesso. ho provato anche ad aggiungere la betaina e il DMSO nella mix, e ho usato anche un gradiente di temperatura.
cos'altro posso fare??
grazie
|
|
|
|
|
valia
Moderatore
Prov.: UK
1001 Messaggi |
|
|
marina1983
Nuovo Arrivato
18 Messaggi |
Inserito il - 16 febbraio 2008 : 15:46:00
|
grazie,
modificherò l' extension time.
speriamo!!
ciao ciao
|
 |
|
|
Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 16 febbraio 2008 : 16:33:53
|
Citazione:
Messaggio inserito da marina1983
ciao a tutti!
sto facendo una PCR utilizzando 2 coppie di primer. nella prima coppia i primer hanno una temperatura di melting di 60, nella seconda di 60 e 58.
le 2 coppie amplificano dei frammenti molto grandi, 1500 e 1200 paia di basi rispettivamente.
lo so che i frammenti sono molto grandi, ma purtroppo devo provarci lo stesso. ho provato anche ad aggiungere la betaina e il DMSO nella mix, e ho usato anche un gradiente di temperatura.
cos'altro posso fare??
grazie
In genere si può risolvere facilmente aggiungendo un po' di Pfu alla Taq come è stato già suggerito, questo è il metodo più diffuso per fare PCR lunghe.
Se così non esce, il mio consiglio forse apparirà un po' più banale, però con me ha funzionato.
Ho disegnato altri due primers che si annilano sul prodotto templato in modo tale da produrre un frammento di PCR più corto per ciascuna estremità, questo per dimostrare che i primers si annilano bene e che il tutto funzioni, oltre che per vedere l'efficienza di amplificazione.
Nel mio caso mi accorsi con molto disappunto che la Tm che mi aveva consigliato Vector NTI ed anche quella che mi avevano consigliato quelli della Primm (che sintetizzano gli oligo) era una temperatura completamente sbagliata di circa 15°C e 20°C di differenza. Infatti l'amplificato di 600 basi si poteva appena percepire con 40 cicli di amplificazione ed aumentando il tempo di annealing ad 1 minuto.
All'epoca rimasi sbalordito, per cui feci una ricerca della problematica in modo più serio su pubblicazioni che calcolano la Tm degli oligo e trovai un sito che calcola la Tm in base a calcoli empirici basate sulla sequenza dell'oligo... la Tm che venne fuori era completamente fuori scala ed io disperato la provai comunque, la PCR uscì.
Ovviamente da allora faccio sempre il calcolo della Tm con almeno 3 algolitmi diversi e nel 99% dei casi si differenziano solo per 2-3 °C, ed evito quelle sequenze con differenze più grandi.
Dico questo non tanto per invitarti a vedere la Tm giusta, ma per consigliarti che a volte il problema potrebbe essere al di fuori della nostra fantasia, meglio prima provare che entrambi gli oligo alle estremità funzionano bene a quella temperatura ed a quelle condizioni, valuti l'efficienza... poi provi a fare una PCR più lunga.
Io sono arrivato a 3700 bp con una Taq normale Eppendorf eliminando la temperatura di annealing (solo 2 steps nei cicli) disegnando gli oligo come per la Real-Time, dove la temperatura di melting è la stessa di quella dell'elongazione, per cui i cicli durano di meno e l'efficienza è notevolmente migliore.
L'altra possibilità è una di cui ho solo sentito parlare, ma quando la tentai non mi funzionò, si basa sul principio della mutazione ABC, ovvero disegnare un paio di oligo al centro del frammento (forward e reverse)con un'overlapping di 20-30 basi (lunghezza degli oligo). Fai la PCR con i 4 oligo, e dovresti ottenere l'amplificato della prima metà e della seconda metà, e nel corso della PCR si dovrebbero allineare tra loro per l'estremità per circa le 20-30 basi centrali e dare quindi l'amplificato finale.
Si dovrebbe mettere un po' più di Taq,
però ripeto ne ho solo sentito parlare per un tipo di screening, lungi da me ritentarla.
 |
|
|
| |
Discussione |
|
|
|
Quanto è utile/interessante questa discussione:
| MolecularLab.it |
© 2003-18 MolecularLab.it |
|
|
|
PCR
Didattica
