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Autore

Discussione

Ele Ele
Nuovo Arrivato

Prov.: Milano
Citt�: Trezzano Rosa

17 Messaggi

Inserito il - 27 marzo 2008 : 20:26:29

Ciao a tutti!
qualcuno mi sa dire un buon protocollo x effettuare esperimenti di immunofluorescenza?!
Grazie
ele

Eleo
Nuovo Arrivato

Prov.: Pavia

89 Messaggi

Inserito il - 31 marzo 2008 : 10:38:38

su cellule io uso questo, poi possono essere necessarie variazioni ma in tal caso si va per tentativi:
IMMUNOFLUORESCENZA SU COLTURE CELLULARI

� Il giorno prima (anche 8 ore) seminare su ciascun vetrino coprioggetto 22X22/24X24 circa 250000/400000 cellule (dipende dalle dimensioni cellulari e dalla loro disposizione nello spazio) in 2 ml di terreno completo. (Per evitare cluster spipettare molto bene e dopo averle seminate ritirare velocemente la piastra a 37� C).
� Il giorno seguente aspirare il terreno e lavare dai residui di terreno con 2 ml di PBS molto delicatamente per non staccare le cellule;
� Fissare le cellule con uno dei seguenti metodi:
- metanolo precedentemente conservato a -20� C per 4 minuti a 4�C (fissa e permeabilizza)
- PFA 1-4% per 10 minuti a temperatura ambiente
� Permeabilizzare le cellule se necessario con PBS-Triton 0,1-0,5% (se si � usato metanolo non permeabilizzare) per 5 minuti a 4� C
� Lavare 3 volte per 4 minuti ciascuna con PBS;
� Incubare con l�anticorpo primario in PBS-latte 2% in camera umida per 1 ora a 37�C o o.n. a 4� C (dipende dall�anticorpo);
� Lavare 3 volte per 4 minuti ciascuna con PBS;
� Incubare con l�anticorpo secondario coniugato al fluorocromo diluito in PBS-latte 2% per 30-45 minuti al buio in camera umida a 37� C
� Lavare 3 volte per 4 minuti ciascuna con PBS al buio;
� Incubare con 2ml di DAPI 0,1 #956;g/ml freddo per 4 minuti a 4� C;
� Lavare una volta per 5 minuti;
� Montare il vetrino sul portaoggetto con il montante antifade o con mowiol;
� Lasciare asciugare e sigillare con lo smalto e conservare a 4�C.

Variazioni:
si pu� usare lo ioduro di propidio per controcolorare i nuclei;
si possono utilizzare montanti contenenti DAPI o ioduro di propidio in tal caso dopo l�ultimo lavaggio dopo il secondario si monta il vetrino normalmente.
Prima di utilizzare la paraformaldeide sulle cellule controllare che il pH sia tra 7 e 8 e buttare se avanza. Preparare la paraformaldeide al 4% e conservarla a -20�C aliquotata e diluire solo l�aliquota di interesse.
Preparare sempre PBS-Triton al momento dell�utilizzo; il PBS-latte pu� essere preparato precedentemente, in tal caso conservarlo in frigorifero e prima dell�utilizzo controllare che non sia andato a male (puzza di latte andato a male e ci sono coaguli in sospensione).
Conservare il DAPI a 4� C al buio
Per preparare la paraformaldeide 4% pesare 4 g di PFA e diluirli in 100 ml di PBS 1X portare la temperatura a 50-60� C fino a completo scioglimento se non si scioglie aggiungere NaOH che favorisce lo scioglimento e poi riportare il pH in un range di neutralit� con HCl, raffreddare, aliquotare e conservare a -20�C.

chick80
Moderatore

Citt�: Edinburgh

11491 Messaggi

Inserito il - 31 marzo 2008 : 13:18:31

C'� anche un protocollo nella sezione protocolli del sito!

http://www.molecularlab.it/protocolli/protocol.asp?id=22

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