Sono stati messi a punto dei sistemi di selezione che favoriscono
la selezione dei ceppi dei cloni mutati:
Doppio Primer
Ho sempre il mio ssDNA che contiene il mio gene clonato, questo
plasmide di partenza ha però 3 geni di selezione per E.coli,
quello con la Tetraciclina, che è funzionante, e quello dell’Amp
che presenta una mutazione. Quindi il plasmide di partenza, se usato
così, lascia E.coli AmpS. Da questo plasmide di partenza
si fa un single strand, si annila l’oligo (come prima), ma
si annila anche un altro oligo che porta il gene wild-type per la
resistenza all’ampicillina. In pratica ho un annealing con
due oligo e due misMatch. Aggiungo, come al solito, polimerasi (T4
o Kleenow a scelta), aggiungo nucleotidi, faccio avvenire la synth
del 2° strand e aggiungo ligasi per chiudere il nick.
Avrò un plasmide ds in cui lo strand interno porterà
il gene TetR, il gene AmpS, e il gene X wild-type, e lo strand esterno
porterà il gene TetR, il gene AmpR, e il gene X mutato.
Trasformo E.coli, seleziono Tet e Amp, cresceranno solamente le colonie
che avranno ricevuto lo strand modificato. In questo modo tutti i cloni
che ottengo sono mutati, come resa totale saranno di meno, ma non
ho un altro screening da fare (selezione 100%). Ed infatti avevamo
detto che la mutagenesi sito-diretta porta all’analisi di
pochi cloni finali.
Metodo di Kunkel (o dei ceppi
Ung–).
È sempre ssDNA, ma utilizza ceppi che sono Ung–.
Sappiamo che in genere l’Uracile non viene incorporato nel
DNA, e se ciò dovesse accadere c’è un enzima,
l’Uracile-N-Glicosilasi (Ung), in grado di riconoscerlo ed
eliminarlo.
Inoltre il ceppo che vioene usato ha pure una mutazione che fa sì
che la concentrazione interna di dUTP sia maggiore, in modo da competere
con il dTTP. In questo modo io favorisco l’incorporazione
nel DNA di U. (ing. metabolica della sintesi del timidilato).
Utilizzo questo ceppo di E.coli per fare ssDNA, quindi con l’M13
posso infettare questo tipo di E.coli, isolo l’ssDNA che avrà
uno strand solo con le U al porto delle T, dopodiché sono
in vitro.
A questo punto ho il mio oligo con la mutazione, fosforilato in
5’, faccio avvenire l’annealing, e sintesi del 2°
strand, ligasi, plasmide ds che avrà lo strand interno con
tutte le U al posto delle T nel gene X wild-type, quello esterno
(fatto in vitro) con tutte le A nel gene X con la mutazione (mismatch).
Ora trasformo un ceppo di E.coli normale, il suo sistema di riparo riconosce
le U e quindi quel filamento viene degradato. Ne derivca che si replicherà
solamente lo strand esterno, e, una volta che andrò a piastrare
su ampicillina tutti i cloni che otterrò sono quelli con
il mio gene mutato.
